Thrombospondine

Thrombospondine2017-03-05T16:29:38+00:00

INTRODUCTION

En 1978, avec des travaux sur  les plaquettes provenant de sang humain il va être découvert, isolé et caractérisé pour la première fois des glycoprotéines ayant un poids moléculaire élevé. Puis quelques années plus tard c’est le nom de baptême Thrombospondine qui sea adopté en particulier pour la protéine isolée des plaquettes. Cela en particulier car cette protéine fut  identifiée comme une glycoprotéine libérée des granulés α des plaquettes suite à un clivage par la thrombine, d’où le nom en référence aux travaux pionniers ici indiqués qui datent de 1971.

Une identification plus  précise de la première forme de Thrombospondine isolée  sera exécutée en 1981,

La Thrombospondine

On trouve dans un tableau récapitulatif les données spécifique sur les diverses formes connues de Thrombospondine avec pour plus de détails le lien SwissProt suivant :  P07996 ;  P35442 ; P49746; P35443.

L’ensemble de ces données permet de dresser un premier portrait-robot de cette protéine comme présenté ci-contre selon les données de séquences acquises et avec les nouvelles notions sur l’organisation de chacun des motifs que l’on va progressivement mieux identifier.

Puis progressivement ces divers motifs seront connus quant à leurs structures en trois dimensions. On va déduire l’arrangement spatial d l’ensemble de la Thrombospondine progressivement. Seulement en 2006 pour ce qui concerne la partie N-terminale, avec des informations sur  la zone 358-530 comprenant les motifs TSR1, TSR2 et TSR3 en 2002, puis en 2005, l’organisation spatiale de  la zone riche en calcium comprise dans la séquence entre les résidus 550 à 1170  avec cependant dans la version de Thrombospondine-2 un site additionnel pour le calcium.

Cependant c’est inspiré d’un article de 2011 que l’on présente le portrait-robot de la Thrombospondine le plus à jour avec comme suit son architecture en domaine selon la nomenclature que l’on a actuellement adoptée (voir l’article de référence indiqué). .Dès l’origine on va définir 4 segments différents dans cette protéine et identifier jusqu’à 8 zones distinctes que l’on indiquera chacune respectivement par les lettres de A à H.

On trouve un petit domaine globulaire (=région A) N-terminal LG  (laminine G-like) suivi par la région B avec le  domaine amino-terminal; vWF  (von Willebrand) qui correspond aux région C et D, une suite de 3 domaines dits Thrombospondines de type 1 TRS (=région E), puis une suite de 3 domaines qualifiés de EGF-like (facteur de croissance de type 3)=(région F),  ensuite un ensemble de 7 zones dites Lectine L susceptible de réaliser une liaison du calcium (=région G) et finalement la partie constituant un large domaine C-terminal (=région H).

En référence avec les travaux publiés en   2013, les Thrombospondines comme des protéines connues depuis longtemps  possèdent bien en commun le domaine vWF mais les domaines suivants sont parfois désignés comme les domaines de type 1, type 2, puis type 3 pour se terminer par  une zone qui est la partie la plus homologue et qui forme  le domaine globulaire C-terminal.

Rôle des Thrombospondines

Dès 1986 on va déterminer plusieurs fonctions pour les Thrombospondine en relation avec la structure que l’observait en particulier en utilisant une analyse via la microscopie électronique. Ainsi cette glycoprotéine allait montrer de relatives multi fonctionnelles propriétés versatiles dans l’organisation du cytoplasme cellulaire. Un schéma récapitulatif obtenu à partir des analyses en ME donne une idée de l‘assemblage des Thrombospondines.

Puis en 1987,  les données s’affinent  quant à l’adhésion cellulaire et le rôle des Thrombospondines dans l’homéostasie cellulaire. Par ailleurs c’est une analyse au sein des cellules nucléées et des plaquettes qui permet d’identifier et de confirmer un rôle des Thrombospondines dans le processus modulaire de l’adhésion.

On y trouve en particulier la notion que la chymotrypsine est susceptible de provoquer es clivages au sein de la Thrombospondine avec perte du N-ter mais aussi générant selon présence ou absence du calcium des fragments conservant ou perdant la partie C-ter.

En 1988, une nouvelle analyse présente les glyco-conjugués et le potentiel  rôle dans l’adhésion cellulaire avec  cas des protéines adhésives laminine, de la Thrombospondine et du facteur de von Willebrand qui se lient spécifiquement aux glycolipides sulfatés. Une eue aborde alors plus largement la Thrombospondine et sa fonction dans l’adhésion cellulaire.

En 1990,  une revue résume l’ensemble des connaissances acquises sur la physiologie des Thrombospondines, puis une année plus tard  c’est un ensemble de données sur la Tenascine et les Thrombospondines qui indique la façon dont il y a modulation des interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire.  Il est alors déterminé à cette date (1991) qu’il existe trois isoformes de Thrombospondine dérivées de la forme humaine  (THBSI). On trouve comme indiqué sur le schéma présenté ci-contre, la forme  TSpl80 ou Thrombospondine plaquettaire, la forme TSpl40, l’homologue humain du hamster gpl40 et la forme dite TSp50. Sur ce schéma l’exon peptide signal est indiqué par (Sig). Pour la forme TSpl40 il existe un épissage alternatif  qui près du début du domaine de type procollagène (Koll), conduit à l’élimination de la liaison à l’héparine (Voir schéma et détails dans l’article original).

Fonction de la Thrombospondine

En 1992, il est définitivement établi que les Thrombospondines sont en fait des structures trimèriques de 450 kDa, assemblage de 3 entités d’environ 150 kDa  et on analyse alors en détail l’expression, la structure et la régulation de cet assemblage. Mais de lus une étude porte plus précisément  sur le rôle potentiel de cette assemblage dans le processus de modulation de la fibrinolyse.

Quelques années plus tard on accumule alors de nombreuses informations sur la Thrombospondine de type -1  avec une relation pour les tumeurs angiogéniques et le cancer des poumons

En 2000,  on approche d’une meilleure définition de la structure des Thrombospondines de type 1 et de type 2 avec une organisation en 4 domaines bien différents et bien spécifiques comme le montre sur un schéma récapitulatif présenté ci-contre.

Puis progressivement on va alors attribuer à la forme de Thrombospondine de type 2  diverses fonctions comme protéine de la matrice cellulaire et par ailleurs mieux définir la biologie cellulaire de la Thrombospondine de type -1 (= TSP-1). Un schéma général replace l’ensemble des Thrombospondines 1, 2 ,3 et 4  sur même schéma résumant comparativement les Domaines similaires et les domaines absents.

De plus l’organisation membranaire de la Thrombospondine de type 1 et les protéines distribuées à la membrane cellulaire sont ainsi répertoriée sur un schéma de synthèse sur le sujet des partenaires des Thrombospondines comme cela est présenté ci-contre (Voir détails dans l‘article en référence)

Puis en 2003 une revue présente la potentielle implication des Thrombospondines de type 1 et 2 comme des inhibiteurs de l’ angiogénèse et résume dans un schéma la possible action au niveau des cellules de types ECs  (=cellules endothéliales de micro-vaisseaux mises en culture) comme cela est représenté dans ‘illustration directement issue de l’article en référence.

En 2004, une étude approfondie permet de mettre  (HBD), interagit avec une variété de macromolécules comprenant aussi les protéoglycanes de sulfate d’Héparane à la membrane et dans la matrice. Cela en fait un domaine à part entière bien spécifique. On trouve ainsi des associations avec la protéine liée au récepteur de LDL (LRP), la protéine sulfatée, les glycolipides, la Calréticuline et les diverses Intégrines. Un schéma général reprend l’ensemble de ces informations comme cela est illustré ci-contre (Voir détails dans l’article en référence). On notera également que la Thrombospondine s’exprime bien dans le muscle.

 

Puis de 2005 à 2006, il va être déterminé que les taux d’expression de la Thrombospondine 2 augmentent chez les souris âgées et cela conduit à diverses conséquences pour la cicatrisation cutanée et l’angiogenèse chez cet animal comme le montre le travail en référence. Par ailleurs, la protéolyse limitée de la Transglutaminase tissulaire à la surface cellulaire par la métalloprotéinase-2 contribue aux défauts de d’adhésion et aux anomalies matricielles dans les fibroblastes chez les souris qui sont déficientes en Thrombospondine-2. Par contre une déficience n Trombospondine-1 ne semble pas affecter le développement du tissu adipeux.

En 2008, une meilleure définition  des structures des Thrombospondines sera  bien établie. Ainsi on aura dans un premier temps une visualisation sur un schéma simplifié des structures modulaires des différents  membres de la famille des Thrombospondines : les formes THBS-1 et -2 correspondant au groupe A capable de former des trimères, puis les formes THBS-3, -4 et -5 correspondant au groupe B et capable de former des Pentamères. Les modules sont colorés comme suit: THBS-N (rouge), bobine en spirale d’oligomérisation (Orange), VWC (jaune), TSR1-3 (nuances de vert), EGF-like répète (nuances de bleu-vert, avec des répétitions de liaison au calcium prédites ou connues colorées dans l’ombre la plus sombre), calcibure Fil (bleu), module de type lectine (pourpre). Les terminaisons N et C sont également indiquées. Le schéma ci-contre résume ces diverses structures

De plus dans le même travail on va décrire et illustrer l’organisation spatiale  des Thrombospondines en proposant un modèle de la structure complète d’un groupe de THBS comme cela est déjà présenté plus haut. Chaque couleur des structures spatiales présentées dans le schéma est produite à partir de l’article en référence, respecte l’agencement proposé dans le schéma précédent et l’architecture des diverses chaînes reprend l’organisation en 4 domaines des Thrombospondines.

En 2010, les métalloprotéinases matricielles, une Désintégrine et diverses métalloprotéinases avec des motifs de Thrombospondine ont été identifiées dans des maladies non néoplasiques.
Par ailleurs une nouvelle étude démontre que la Thrombospondine-1est à considérer comme un marqueur unique pour identifier l’activation plaquettaire in vitro et lors de la surveillance de ces processus in vivo.

En 2011, une nouvelle revue permet de faire le point sur les Thrombospondines et de donner une vue d’ensemble de cette famille de protéine comme indiqué dans le schéma suivant en référence au portrait-robot présenté plus haut. On aura alors des informations spatiales sur l’architecture légèrement différente de certaines portions des diverses Thrombospondines avec les domaines manquants et /ou supplémentaires selon les versions présentées comme cela est indiqué dans le schéma récapitulatif présenté plus haut.

Il existe selon ce travail une relation entre les variations du gène de la Thrombospondine, les facteurs de von Willebrand et le risque de maladie coronarienne chez une population plus âgée. Une variante fonctionnelle dans le gène de la Thrombospondine-1 est décrite en relation avec de petits risques pour un stage gestationnel chez les enfants.

En 2012, ce travail présente les Alpha-Défensines neutrophiles humaines qui induisent la formation de structures fibrinogènes et de type amyloïde avec la Thrombospondine-1 et activent les plaquettes via la glycoprotéine IIb / IIIa. Dans le cadre de la synaptogénèse dans le système nerveux central,  il est maintenant acquis que la Thrombospondine est bien un acteur clé de cette étape du développement cellulaire. Dans une illustration directement issue de ce travail on va trouver le type d‘association spécifique que l’on observe pour la Thrombospondine dans ce milieu ainsi que les différentes voies de signalisation que cela concerne, comme cela est indiqué dans le schéma présenté ci-contre.

Pour autant, la Thrombospondine-1  une protéine appartenant à la matrice cellulaire régule globalement la fonction cardiovasculaire et les réponses au stress via la protéine CD47.

Un schéma récapitulatif monte d’une part les différents partenaires potentiels susceptible de recevoir la Thrombospondine et d’autre par les principales conséquences que cela est capable d’entraîner. On trouvera par ailleurs dans le même article des détails sur les voies de signalisations impliquées dans la régulation du système vasculaire en particulier sur les concentrations e calcium en NO et sur les différentes drogues pouvant activer l’expression des  sGC.

En 2013, une nouvelle revue présente les Thrombospondines comme des protéines connues depuis longtemps mais impliquées dans de nouveaux rôles que ce travail indique en détails. En particulier on y trouve des informations dans le cadre dans le cadre des lésions potentielles résultats d’une artériosclérose. Tant la forme TSP-1 que la forme TSP-4 affectent la teneur des lésions sans affecter l’accumulation de lipoprotéines dans la lésion aux stades inflammatoires postérieurs. La TSP-4 est requise pour le recrutement de macrophages dans la lésion et leur migration à travers la lésion. Il en résulte une inflammation locale plus faible (niveaux inférieurs de protéines d’adhésion et de cytokines). La TSP-1 régule la phagocytose dans les macrophages avec parfois  un noyau nécrotique plus important du fait d’une phagocytose insuffisante.

En 2014, le processus de la régulation de l’expression des Thrombospondines est abordé dans ce travail et met en lumière le pouvoir de ces protéines dans la cellule en général. On trouvera également des données pour l’influence sur l’angiogenèse oculaire, la guérison des plaies et l’ immunorégulation, processus qui sont tous dépendant de a présence des Thrombospondines. Un schéma reprend la distribution tissulaire des Thrombospondines est présenté ci-contre pour résumer simplement les données développées dans l’article en référence.

Puis ce travail particulier présente plus spécifiquement l’impact de la  Thrombospondine-2 sur l’assemblage de la matrice extracellulaire. En fait il est alors réalisé dans ce travail , et plus particulièrement pour ce qui concerne les formes 1 et 2 des Thrombospondines,  un bilan sur les différentes zones définies sur le portrait-robot de la protéine en rapport avec les divers partenaires actuellement connus susceptibles d’interactions, sans tenir compte de l’assemblage en  trimère,  et pour rendre un tel schéma visible un seul monomère de Thrombospondine est présenté ci-contre avec une liste de quelques associations possibles actuellement connues en 2014.

Enfin cette même année, ce travail présente une reprise du rôle de la Thrombospondine-1 en relation avec  la signalisation CD47, interaction qui  régule la cicatrisation des lésions thermiques chez la souris.

Cependant pour un complément d’informations on trouvera  ainsi la liste des divers ligands  susceptibles d’association avec les Thrombospondines dans un tableau qui figure dans le travail en référence. Ce bilan sus la forme d’un intitulé l’ interactome en relation  avec la forme de Thrombospondine  de type 1 figure dans la référence ici indiquée. Un schéma très simple résume l‘ensemble de ces divers partenaires avec une classification selon le compartiment

Par ailleurs, ce nouveau travail donne un aperçu sur les divers  membres de la famille des gènes de la Thrombospondine qui se lient à la molécule d’interaction stromale 1 et régulent l’activité des canaux calciques.

Thrombospondine et les pathologies associées

Dès 1987, on avait découvert que des défauts au niveau de la  Thrombospondine  étaient responsable de cas clinique spécifiques d’un certain type  de maladie.
Puis en 1992, la Thrombospondine est clairement identifiée comme un  facteur  responsable de la  nécrose tumorale. En fait la  Thrombospondine est alors considérée comme un médiateur de l’adhésion des cellules cancéreuses dans les métastases. L’année suivante il est mieux défini dans un travail soigneux  le type des fonctions de la Thrombospondine et son implication dans la physiologie et la pathophysiologie.

En 1995, une étude démontre la modulation de la Thrombospondine et d’autres inhibiteurs naturels de l’angiogenèse au cours de la progression tumorale. Une année plus tard, en 1996, le rôle de la Thrombospondine-1 est clairement impliqué dans la progression tumorale et l’angiogenèse. Ainsi cette autre étude  indique que l’expression de la Thrombospondine-1 dans le cancer joue un rôle majeur dans la progression tumorale. Puis ce travail s’attache à mettre en évidence que la régulation de la croissance tumorale et des métastases sont bien des processus sous le contrôle de la Thrombospondine-1.

 En 1997, il est alors conçu que la Thrombospondine était à considérer comme un  régulateur de l’angiogenèse.

Dans les années 2000,  les Thrombospondines sont indiquées  comme modulateurs matricellulaires de la fonction cellulaire (2001). Puis en 2002 un travail place la Thrombospondine  de type 1 comme un des acteurs important qui agit au cours du processus de l’apoptose cellulaire.  Un schéma issu de ce travail récapitule le cycle de le Thrombospondine-1 au cours d’un tel processus comme le montre l’illustration présentée  ci-contre.

C’est  en 2003 que les 2 Thrombospondines,  de types 1 et/ou 2 sont présentées comme fonctionnant comme des inhibiteurs de l’angiogenèse. Ainsi cette même année 2003, on envisage alors d’utiliser l’expression dirigée de la Thrombospondine en tant qu’agents thérapeutiques anti-angiogéniques. Puis en 2004 une revue présente le potentiel rôle de la Thombospondine-1 dans certains développements de maladie humaines

En 2007, cette étude porte sur le rôle des Thrombospondines dans la guérison des infarctus du myocarde,  tandis que leurs polymorphismes et la relation avec les  maladies cardio-vasculaires, sont abordés dans le détail par cet autre travail. Puis la même année c’est un traitement anti-angiogénique qui est proposé à base de Thrombospondine dans une étude originale. Enfin c’est l’importance de l’’oxyde nitrique et l’un de ses  récepteurs la Thrombospondine-1 qui est étudié dans l’angiogenèse tumorale.

En 2008, une nouvelle revue se penche sur le potentiel rôle des Thrombospondines dans le développement des cancers.  Puis une année plus tard une autre revue se penche plus précisément sur les pathologies rénales en relation avec les Thrombospondines.  On y trouve en particulier un récapitulatif des actions faisant intervenir les Thrombospondines de type 1 et de type 2 dans diverses processus cellulaires. Un schéma présenté ci-contre résume la situation

En 2011, la Thrombospondine de type 1 se trouve clairement impliquée dans diverses voies de signalisation qui conduisent à une inflammation cellulaire.

En 2012, c’est la Thrombospondine-4, qui est défini comme un inducteur faible de l’apoptose du facteur de nécrose tumorale (TWEAK) et son récepteur Fn14. L’ensemble de ces nouveaux facteurs de modulation de la matrice extracellulaire sont analysés  dans le remodelage cardiaque. Une vue schématique des facteurs et des voies sélectionnés qui sont impliqués dans la régulation du remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cardiaque et des rôles potentiels de la Thrombospondine-4 (TSP-4)  par rapport à l’entité TWEAK / Fn14 dans ce processus est présentée ci-contre comme dans l’article en référence. . La quantité d’ ECM cardiaque est déterminée par l’équilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines de l’ ECM, qui est  régulée par des facteurs comme les MMPs et TIMPs. La qualité du myocarde est affectée par plusieurs facteurs tels  les réticulations intermoléculaires entre les fibres de collagène. La protéine matri-cellulaire TSP-4 et la voie TWEAK / Fn14 semblent avoir des effets importants sur la structure des protéines de l’ ECM cardiaque et l’homéostasie impliquant la protéine TSP-4 et TWEAK/Fn14 dans un tel processus.

En 2013 ce sont les Thrombospondines, qui représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies cardio-vasculaires. Alors finalement une revue indique le rôle de la thrombospondine-1 comme plus particulièrement impliquée dans la santé cardiovasculaire et la pathologie.

En 2014, dans cette analyse il est repris le rôle et la régulation entre  Thrombospondine-1 (TSP-1)  et CD47 au niveau des réponses cardiaques, pulmonaires et vasculaires dans un cas d’un témoin normal par rapport à le cas d’une maladie impliquant cette protéine. Un schéma reprend les données acquises en 2012 et le tableau est complété avec les informations de l’article en référence. Dans les cellules endothéliales hypoxiques, la forme TSP1, via CD47, perturbe la relation Caveolin-1-eNOS et favorise l’augmentation de la production  des espèces d’oxygène réactif (ROS).  Les ROS limitent alors  davantage la vasodilatation en éliminant le NO. C’est l’ensemble de ces processus indirects qui favorisent la vasoconstriction et diminuent le flux sanguin. Ainsi sur un schéma récapitulatif il est indiqué que la TSP-1 se lie et active le récepteur cellulaire CD47 pour limiter le flux sanguin directement et indirectement.

En 2015, on va envisager un ciblage thérapeutique du complexe entre Thrombospondine-1 et CD47 pour traiter le cancer du foie.

Puis c’est un travail qui fait ne corrélation entre la Thrombospondine-1 et la pathogenèse de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Une représentation schématique d’un monomère de Thrombospondine-1 (TSP-1) et sur ce portrait-robot l’emplacement des divers sites de liaison, avec du côté amino-terminal, le domaine de liaison à l’héparine qui interagit avec les protéoglycanes de sulfate d’héparane de surface cellulaire (HSPG), et le(LPR1), de même que  éventuellement le récepteur lipoprotéique de très faible densité (VLDLR). La Thrombospondine de type 1 est associée avec  le récepteur CD36, et le peptide associé à la latence (LAP) avec une liaison pour le  TGF-bêta. Le domaine de liaison cellulaire carboxy-terminal contient 2 séquences valine-valine-méthionine (VVM) qui interagissent avec les récepteurs CD47, notamment à la surface des macrophages. Le schéma présenté ci-contre résume une telle situation ?

Ensuite sera publié une étude sur des aperçus originaux pour proposer des stratégies antirécepteurs liées à la Thrombospondine-1 dans le cas général  des  cancers.

Avancés depuis fin 2016

Dans ce travail le rôle intracellulaire pour la forme Thbs4 de Thrombospondine, dans le muscle squelettique, est démontrée comme susceptible d’augmenter sélectivement le DGC et la fixation des intégrines complexées aux structures vésiculaires vers la membrane, ce qui va conduire à une plus grande stabilité de ces complexes au sarcolemme. En particulier cela va améliorer ainsi la stabilité mécanique de la myofibres. Cette étude permet d’identifier la Thbs4 comme composant crucial pour maintenir l’intégrité de la fibre musculaire. Ainsi  la perte de Thbs4 entraîne une faiblesse du sarcolemme et provoque des changements dystrophiques spontanés avec le vieillissement. Il est ainsi observé un effet protecteur de la Thrombospondine dans le muscle squelettique chez la souris mais aussi chez le modèle animal la drosophile. Un schéma résume le cycle de la Trb4 dans un muscle normal comme cela est présenté ci-contre (Voir également dans l’article original en cas de déficience de Trb4).
En 2016, les Thrombospondines dans la transition de l’infarctus du myocarde à l’insuffisance cardiaque sont présentées dans ce travail comme des acteurs de premier plan. Il est ainsi acquis que les Thrombospondines permettent de réguler l’inflammation et le remodelage de la matrice fibrotique après infarctus du myocarde  (MI= Myocardial Infarction). Comme les autres protéines de la matrice cellulaires, la famille des TSPs interagit avec de multiples types de cellules différentes dans le myocarde pour induire leurs effets. Les formes TSP-1 et le TSP-2 affectent le remodelage par leurs interactions avec le facteur de croissance transformant β (TGFβ) et sa signalisation dans les fibroblastes, les métalloprotéinases de matrice (MMP) et les interactions avec le  CD47 sur les lymphocytes T. Il est suggéré que la TSP-4 soit pro-inflammatoire (contrairement à la TSP-1/2) par des interactions avec les macrophages.

De plus, la TSP-4 peut inhiber le processus de collages (éventuellement par liaison directe et interaction), et ceci peut impliquer la régulation transcriptionnelle du facteur 6 de Krüppel (KLF6) par la TSP-4. Ainsi le processus avec intervention des diverses formes de TSPs  est illustré dans le muscle comme cela est présenté ci-contre au cours de l’étude citée plus haut  (voir détail dans l’article original).

Par ailleurs dans ce travail orignal c’est plus particulièrement le rôle de la Thrombospondine 1 qui est de nouveau analysée dans les maladies du foie. Puis  on aura une étude plus récente sur  le rôle de la Thrombospondine 4 dans les petites artères et son impact dans le processus de  l’hypertension en particulier si on en programme l’absence .

En conclusion

Pour suivre l’évolution des connaissances sur les Thrombospondines il existe des banques de données récentes qui sont  automatiquement mises à jour qui répertorient :

A)     Les diverses Thrombospondines  avec son lot de références historiques.

B)      Les principales maladies actuellement connues qui résultent d’une mutation ou d’un défaut dans la protéine considérée (avec des références associées).

 Protéine : THROMBOSPONDIN I; THBS1

Pathologies associées :non identifiée  en 2016

Protéine :  THROMBOSPONDIN II; THBS2

Pathologies associées : INTERVERTEBRAL DISC DISEASE; IDD

Protéine :  THROMBOSPONDIN III; THBS3

Pathologies associées: :non identifiée  en 2016

Protéine : THROMBOSPONDIN IV; THBS4

Pathologies associées : :non identifiée  en 2016