Nébuline

Introduction

Rapidement après la découverte des filaments d’une part dits « fin » d’Actine et « épais » de Myosine, l’organisation de ces filaments semblait devoir être stabilisé par d’éventuelles protéines organisatrices de telles structures à multipartenaires. Les recherches furent nombreuses et on fut bientôt capable en 1982 de proposer une purification  de 2 organisateurs spécifiques d’un part pour le filament épais (la Titine voir fiche) et pour le filament fin la Nébuline.

La Nébuline

résumé des séquence de NébulineAinsi la Nébuline fut d’abord décrite comme une protéine géante du muscle qui est étroitement associée avec le filament fin d’actine (F-Actine). Elle est connue pour ancrer son extrémité C-terminale au niveau de la ligne Z du sarcomère. Son gène est répertorié sous le sigle NEB. Les informations de séquences concernant cette protéine géante sont réunies dans le tableau ci-contre avec un lien SwissProt pour plus de détails : P20929.La  séquence primaire de la Nébuline est désormais connue et son portrait-robot indique la présence :

– de 185 motifs spécifiques aussi désignés comme des zones répétitives « Nébulines »

– et d’uniquement 1 seul domaine de type SH3. Les domaines SH3 sont des séquences capables de favoriser l’interaction avec d’autres protéines possédant une séquence riche en Proline, ( voir définition plus complète ). Selon un même principe de nomenclature des segments de protéine présentant une relative homologie entre eux et identifiés similaires à ceux identifiés au cours de l’étude plus précisément de la kinase dite SRC (voir fiche spécifique sur sa découverte et son rôle dans la cellule), il sera nommé un nouveau domaine, le domaine SH3.  (Avec SH3 = Src Homologie 3 ; (sarcoma (Src)). On pourra consulter une bonne définition du domaine SH3 dans le document présent sur le lien ici  indiqué.

Par ailleurs, et pour éviter une possible confusion,  il est généralement d’usage relativement ancien de codifier les groupements thiols des protéines sous le terme de SH et on aura jusqu’ 5 résidus SH (numéroté de 1 à 5) au sein d’une amylase par exemple.

Le Domaine SH3 de la Nébuline

C’est un  petit domaine d’environ une soixantaine de résidus  susceptibles de se lier à des peptides riches en proline. Le domaine SH3 est  situé en général  à la surface de protéines cibles  dont on va trouver des informations détaillées sur le site indiqué qui décrit la présence d’un tel domaine SH3 au sein de la protéine nommée Vinexine. (Voir également la fiche).

Parmi les plus récentes protéines de la famille des SRC kinase les données sur la kinase dont le sigle est  « HCK » (=Hematopoietic Cell Kinase) permettent de bien définir et illustrer ce domaine SH3.

Séquence primaire du domaine SH3 de la NébulineUn tel domaine SH3 est composé par environ 60 résidus avec présence de 5 feuillet bêta dont l’identification se fait par une lettre de l’alphabet en minuscule correspondant aux lettres suivantes : a, b, c, d, e. En alignant la séquences du domaine SH3 de la Nébuline on retrouve relativement facilement une grande homologie entre ces séquences La séquence primaire prise en exemple correspond à la kinase humaine de type HCK et le schéma ci-dessous donne la distribution des feuillets dans cette séquence. En rouge sont indiqué des résidus conservés dans tous les domaines SH3 et ici plus particulièrement la présence d’une hélice codifiée 310.

SH3 comparatif nébulineEn analysant diverses séquences classées comme représentant des domaines SH3 au sein d diverses protéines on va constater une forte similarité dans la distribution des feuillets bêtas et la représentation spatiale de la séquence SH3 de la Nébuline rentre parfaitement dans cette configuration . Ainsi une comparaison entre différents cristaux obtenus à partir de domaine SH3 isolé on peut avoir une bonne idée cette similitude. L’illustration ci-dessous en référence à la kinase « HCK » dont la séquence primaire a été prise en exemple de domaine SH3, est comparée avec la structure cristalline de la protéine « FUT8 » et celle de la protéine « SRGAP1 » pour finir par l’architecture spatiale du domaine SH3 de la Nébuline. On peut également pour de plus larges informations, consulter les travaux suivant indiquant la structure des cristaux correspondants à des domaines SH3 présents dans différentes protéines comme par exemple, la Kinase dite “ P13K” et/ou la protéine référencée comme “ p130cas”.

Rôle du domaine SH3

Un domaine SH3 participe activement à la reconnaissance d’un partenaire possédant une zone riche en proline comme indique dans l’article en référence qui concerne la protéine “Sem-5 ». Des résidus important sont indiqués (segment de Poly Prolines) dans ce travail pour la bonne fonction du domaine SH3.  Au niveau du NADPH, son domaine SH3 participe au processus d’assemblage et d’activation du phagocyte . Le rôle du domaine SH3 est abordé dans un travail concernant la protéine dite « Murid Herpesvirus-4 (= MuHV-4) ». Une comparaison du domaine SH3 est proposée dans une analyse détaillée sur 24 peptides différents relatifs à ce domaine particulier comme cela est indiqué dans l’article en référence. La structure détaillée d’un domaine SH3 présent au niveau de la Desmoplaskine est rapporté dans l’article indiqué. La polymérisation via un domaine SH3 est documentée dans l’article en référence. La dynamique des feuillets bêta constitutifs d »un domaine SH3 est abordée dans un travail sur la formation d’agrégation amyloïde  Une récente revue fait le bilan sur les domaines SH3 en général.

En résumé une étude fait le point sur la relation entre le domaine SH3 et le domaine PDZ (voir la fiche spécifique à ce domaine).  La relation d’un domaine SH3 avec un ligand, ce qui est spécifique et ce que l’on considère comme consensuel est résumé dans cette référence.

Par ailleurs, tout comme le domaine SH2, le domaine SH3 se trouve être une cible pour lutter contre la prolifération cellulaire. La régulation au niveau d’un domaine SH3 particulier est relatée dans l’étude de la Kinase Crk. Une nouvelle protéine baptisée AHI-1 et le potentiel qu’elle représente pour lutter contre la Leucémie et les troubles cérébraux sont des thèmes abordés dans la référence indiquée. Le rôle du domaine SH3 et sa relation avec des séquences PxxP (riche en Prolines) y est abordé.

Portrait-robot de la NébulinePour ce qui concerne le domaine SH3 de la Nébuline on va progressivement découvrir son rôle par rapport aux nombreuses protéines qui seront associée avec l’extrémité C-terminale de la Nébuline, mais pour l’instant hormis cette portion bien définie de la Nébuline il est important de dresser un portrait-robot de l’ensemble de la séquence constituant le squelette de la Nébuline. Le schéma ci-contre résume l’ensemble des motifs constitutifs. Les zones répétitives d’environ 35 résidus seront identifiées comme des zones de simples résidus tandis que l’on regroupe 7 zones répétitives sous la forme de « super » répétitions. La zone N-terminale comprenant est riche en résidus glutamique tandis que la zone juste avant le domaine SH3 C-terminal est riche en résidus Sérine. L’ensemble de ces données est résumé dans le schéma ci-contre.

Si les zones répétitives sont bien des modules d’environ 35 résidus. Ils possèdent tous la séquence SDxxYK ce qui favorise la fixation en particulier sur le filament de F-Actine. Le groupement de 7 modules consécutifs est répertorié comme une zone de « super répétition » (rectangles bleu) au nombre total de 22 qui possèdent la séquence WLKGIGW. Cette séquence réalise ainsi un marquage naturel périodique de la Nébuline. Cette région des « super répétitions » se situe en majorité au niveau de la bande I du sarcomère. Les « super répétitions » dénotent la duplication du gène de la Nébuline.

Les répétitions simples (rectangles jaunes) qui figurent dans la partie N-terminale se situent proches de la ligne Z tandis que celles proches de l’extrémité C-terminale limitent la fin de la bande I. Ce dernier possède une richesse en résidus Serine (S) et en couple Tyrosine-Lysine (YK) typiques des répétitions de type « Nébulines ».

La partie C-terminale de la Nébuline est unique et contient des informations spécifiques avec en son sein un domaine dit SH3 (rectangle rouge) dont la description et l’analyse figure plus haut. On va aussi définir à l’extrémité NH2-terminale, une région riche en résidus « acide Glutamique » (GLU ; rectangle beige) et une région riche en résidus « Sérine » (SER = petit rectangle violet). Pour plus de détails sur cette organisation  consulter l’article original .

exemple d'épissage alternatif de la NébulinePour autant si en 2004 on va bien connaitre chez l’homme l’organisation complète du gène donnant naissance à la Nébuline on va constater qu’il existe une vingtaine de transcrits différents issus d’épissage alternatifs dans un même muscle. Ci-contre est présentée l’identification de tels transcrits dans un muscle particulier chez l’homme, le  tibialis antérieur, et ce schéma est directement issu du diagramme présenté dans l’article en référence.

correspondance exons et séquence primaire de la NébulineDans ce travail il est également indiqué que de nombreux épissages alternatifs sont possibles et les divers exons trouvés dans la partie codante du gène donne la possibilité d’établir une correspondance avec les domaines et séquences répétitives que contient la protéine. Cela est résumé par un tableau qui reporte les données de 2004 sur ce gène codant pour la protéine géante baptisée Nébuline.

La structure allongée de la Nébuline entraîne que de nombreux partenaires vont être associés avec cette protéine et les zones de contact sont répertoriées sur le diagramme suivant, qui est retranscrit en français par rapport à l’article original .

Partenaires de la NébulineDe la ligne Z à l’extrémité du filament d’actine on va trouver les protéines suivantes : la Tropomoduline Q9NYL9, puis La Tropomyosine P09493, les Troponines , et l’Actine (voir chapitre l’Actine), c’est-à-dire les composants majeurs du filament fin.

Mais on va rencontrer également, la Myosine (composant majeur du filament épais ; Voir chapitre la Myosine), la Calmoduline P62158, la MyBPC (selon les muscles rapide Q14324, lent Q00872 où cardiaque Q14896), la CapZ  P47756, la Desmine  P17661, L’ Archvilline  O95425, L’alpha-Actinine  P35609/ La Titine  Q8WZ42 et la Myopalladine Q86TC9.

contact Nébuline et Titine au sein du SarcomèreUne représentation schématique indique en français parfois plusieurs zones de contacts pour une même entité (voir détails dans la revue originale). Un autre schéma récapitulatif est présenté ci-dessous en français et on y retrouve les principaux éléments du sarcomère ce qui permet de mieux montrer les rapports entre la Nébuline (en rouge sur ce schéma) et la Titine (en bleu sur ce schéma). Des détails sur ce schéma peuvent être consultés   dans la revue suivante .

Rôle de la Nébuline

 

On va rapidement observer que l’absence de la Nébuline va réduire  la taille du Filament Fin et par conséquent altérer les performances contractiles du muscle. Des expériences, en utilisant  des souris complètement déficientes en Nébuline, confirment que cette protéine renforce la probabilité d’attachement des têtes de Myosine sur le filament d’Actine. En fait la Nébuline maintient l’intégrité du sarcomère durant la contraction. Son  absence va donc se traduire par un déficit des performances contractiles dans un muscle.

Séquences de la nébuletteEn fait on peut donc affirmer que la Nébuline,  régule la longueur du filament fin et participe au contrôle des performances contractiles d’un muscle. La Nébuline est en fait l’élément qui va préciser  la largeur des disques-Z et déterminer l’arrangement  latéral de ces derniers en rapport avec les myofibrilles adjacentes. Au sein du  muscle cardiaque on trouvera une version plus courte de la Nébuline qui sera baptisée la « Nébulette » (référencée NEBL ne contenant seulement que 23 motifs spécifiques, aussi désignés comme des zones répétitives « Nébulines » et 1 domaine de type SH3). Les données de séquence sur cette Nébulette sont réunies dans le tableau ci-dessous avec un lien Swissprot pour plus de détails : O76041

Portrait-robot de la NébuletteL’expression de la Nébulette est essentielle à  la mise en place des filaments fins durant le développement du cœur. Cette protéine moins longue que la Nébuline possède cependant un forte ressemblance avec cette dernière et comme on peut le voir sur le portrait-robot présenté ci-contre on va y retrouver en particulier des séquences répétitives notée M au nombre de 23 un zone N-terminale riche en résidu Glutamique et une partie C-terminale correspondant au domaine SH3. Il existe aussi des zones répétitives susceptibles de donner des versions issues d’épissage alternatifs (indiqué par un *)

Cependant, dans le muscle cardiaque, cette  Nébulette présentera des sites d’interactions différents par rapport à la Nébuline du muscle squelettique, comme cela est indiqué dans le schéma récapitulatif présenté au-dessus. Ces nouveaux contacts concerneront des partenaires tels la Filamine-C Q14315 et la ZASP-1 O75112 .

Relation Nébuline et pathologies associées :

Il existe déjà de nombreux travaux rapportant des  mutations au sein de la Nébuline On a découvert au sein des myopathies congénitales à bâtonnets (Nemaline Myopathy) une forme autosomale récessive (AR) dite également ( Core-rod myopathy), liée à la Nébuline (gène NEB).Les mutations au sein de la Nébuline entraînent une  perturbation de la taille des filaments fins d’Actine ce qui s’accompagne d’une relative faiblesse musculaire.

Tout d’abord rapportée dans une population juive homogène ( Ashkenazi Jewish population), le défaut repéré sur la Nébuline correspond à une  délétion  de son exon 55 .Les recherches sur les altérations de la Nébuline semblent se concentrer sur un seul type de mutation avec  une distribution  ciblée chez certaines populations .Même si cela est une myopathie congénitale rare, il en existe  des cas cliniques bien particuliers . Ainsi est-ce souvent  l’absence de la partie C-terminale de la Nébuline qui va conduire à une dystrophie congénitale sévère. On trouvera un bilan plus complet des pathologies concernant la Nébuline qui est généralement compilé dans les revues sur  les pathologies reliées à la perte de l’intégrité du Filament Fin .

Pour complémenter ces données, des informations et des illustrations très récentes sur le rôle et la fonction de la Nébuline sont également  disponible sur le lien indiqué . De plus des images sont actuellement disponibles pour l’association de la Nébuline isolée et du filament d’actine dans le travail présenté dans la référence indiquée.

Avancées depuis 2013

Le cas particulier des muscles extra oculaires et distribution au cours du développement musculaire de la Nébuline au sein du Filament fin d’Actine. Un récent travail présente dans un modèle les deux changements de position spécifiques de la dynamique de l’actine comme impliqués dans un principe sous-jacent responsable de la durée de vie générale des filaments d’actine et de leurs stabilités. Des résultats obtenus dans cette étude suggèrent que des gènes de fusion réciproques de la famille de gènes codant pour les Nébulines pourraient avoir une importance biologique. Dans un autre travail, réalisé « In vivo et in vitro » , des souris hétérozygote souris knock-out  pour la Nébuline présentent un léger phénotype au niveau de ses muscles squelettiques. Les zones dites d’Adhésions focales sont formées par des complexes protéiques multiples qui facilitent la fixation des cellules, la migration et la communication cellulaire. La protéine dite « LASP-2 (=LIM-Nebulette) », est un membre de la famille de protéines dites « Nébulines » qui réalise une liaison avec  l’actine, est un composant nouvellement identifiés de ces complexes.

Une nouvelle enquête présentée dans l’article en référence sur la protéine « LASP-2 »  dans la zone de l’adhésion cellulaire présente dans cet article  ce nouveau partenaire, sa  liaison à l’Actine  et  son  rôle dans la motilité cellulaire. Une activation du muscle squelettique,  de type fibre rapide, par la Troponine augmente la force du muscle squelettique de type rapide chez la  souris et améliore la faiblesse due à une déficience  en Nébuline. La Nébuline (NEB) présente des mutations dans une myopathie distale débutant dans l’enfance : Analyses et  séquençages. Présence de la délétion dite exon 55 avec absence d’une séquence de 35 résidus mais également présence de duplication de parties du gène avec mutations incluses.

La Troponine se présente comme un activateur qui va augmenter la force musculaire chez les patients atteints de myopathie dite « Némaline Myopathie », ceci en rapport  avec des mutations au sein de la Nébuline. Des mutants de la Nébuline sont identifiés comme une entrave à une liaison normale pour un assemblage avec le filament de  Desmine. Une activation de la Troponine de muscle rapide augmente la force d’un muscle squelettique de souris et améliore la faiblesse de l’animal déficient en Nébuline. La suppression de l’exon 55 du gène de la Nébuline induit une faiblesse musculaire sévère chez un modèle de souris avec une  Myopathie à Némaline. Bilan sur la structure des proteins géantes du muscle en particulier la Titine mais aussi la Nébuline.

En 2014, une histopathologie musculaire liée à une myopathie  à Némaline (absence de Nébuline) est ici étudiée en détail et des données sur l’ultrastructure musculaire sont corrélées à la sévérité de la maladie et au  génotype. Les interactions entre Nébuline, Actine et Tropomyosine sont modifiées par des mutations pathogènes spécifiques. Les  2 séquences répétitives de «  type Nébuline » contenues au sein de la protéine LASP-1 (Voir séquence)  régulent l’architecture de la Bande-I et l’espacement des filaments au niveau des myofibrilles.

Une récente Mise à jour des mutations au sein de la  Nébuline  ainsi que des myopathies associées est maintenant disponible dans l’article en référence. En tenant compte des informations apportées par ce travail une tentative de compilation des mutations connues est proposée dans le schéma ci-contre en indiquant que du fait d’épissage alternatifs nombreux et des duplications de séquences qui en résultent parfois la taille de la protéine de type Nébuline se trouve modifiée avec inclusion d’un site supplémentaire de résidus mutés.

En addition il existe aussi de nouvelles identifications des rares variantes hétérozygotes composites au niveau du gène de la Nébuline par exemple chez  une famille coréenne avec une déficience intellectuelle, de l’épilepsie et dès la petite enfance une apparition faiblesse musculaire généralisée.

En 2015, chez le modèle animal, le poisson zèbre, dans le cas d’une myopathie à Némaline ces animaux permettent de révéler un large spectre de cas contribuant à une fonction musculaire réduite. De nouveaux variants de Nébuline sont corrélés avec un développement Familial primaire de glaucome à angle fermé chez le Basset Hound. Une autre étude révèle sur les effets du Levosimendan sur la contractilité des fibres musculaires de patients atteints de myopathie à Némaline ayant  des mutations au niveau du gène codant pour la  Nébuline. L’absence de Nébuline dans un muscle adulte provoque des malformations et des changements d’organisation des sarcomères. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives dans le traitement des myopathies à Némaline. Une relative diminution comparative des profils protéiques par rapport à la quantité de Nébuline dans le muscle est analysée en réponse à une dénervation dans un muscle squelettique.

Mutations connues de la NébuletteAu niveau du Cœur une récente étude analyse plus particulièrement la séquence de la Nébulette et identifie au niveau de plusieurs séquences répétitives de type ‘Nébuline » des mutations affectants la fonction de cette protéine. Un schéma récapitulatif reprend sur le portrait-robot de la Nébulette la localisation de ces mutations et cela est présenté ci-contre.

En 2016,  il est acquis que la Nébuline est en fait une protéine géante qui possède de multiples fonctions.  Dans cette étude il y a un bilan sur l’identification de nouveaux partenaires susceptible d’association pour lesquels sont  fournies des preuves
que la nébuline n’est pas seulement une protéine structurale. La nébuline joue un ainsi rôle dans de nombreux processus cellulaires, y compris la régulation de la contraction du  muscle mais aussi dans la formation des disques Z et dans l’organisation et assemblage de son architecture. Ainsi le profil de la Nébuline indique la présence de plus de 200 sites d’associations avec les molécules d’actine distribuées sur le filament fin et participe ainsi au glissement des tête globulaire de myosine au cours du processus de contraction  du muscle squelettique (voir détails dans l’article en référence).

La Nébulette quant à elle se présente comme est un partenaire de liaison des protéines cytosquelettiques favorisant l’interaction entre la Desmine et l’Actine comme cela est démontré par cette étude sur un cœur chez la souris.

En 2017, Un nouveau patient souffrant d’une myopathie à progression lente est analysé et permet d’informer sur  de nouvelles mutations hétérozygotes dans le gène codant pour la nébuline. Il s’agit d’une part d’une mutation faux sens c.20131CNT: p.Arg6711Trp. D’autre part une autre mutation correspond à  une suppression de 1 pb de c.22924delT: p.Tyr7642Metfr * 10 qui a abouti à un court déplacement de cadre de lecture  (avec neuf acides aminés) puis résultant en  un codon stop. Le schéma de compilation des mutations sur la nébuline inclus maintenant cette nouvelle information

Chez une femme égyptienne enceinte, mariée à un cousin du premier degré, va avorter à la 20éme semaines de son enfant. Le fœtus décède et sera  diagnostiqué avec une mutation de la Nébuline  (c.10872+1G>T), enregistrée comme une mutation déjà connue. Ainsi ce type de mutation est confirmée ainsi comme capable de provoquer  un phénotype sévère et létal à  associer avec un Syndrome de Ptérygium multiple.

En conclusion

Pour suivre l’évolution des connaissances sur La Nébuline et la Nébulette il existe des banques de données récentes qui sont  automatiquement mises à jour qui répertorient :

A)    La Nébuline et/ou la Nébulette avec son lot de références historiques.

B)      Les principales maladies actuellement connues qui résultent d’une mutation ou d’un défaut dans la protéine considérée (avec des références associées).

Protéine :NEBULIN; NEB

Pathologies associées:NEMALINE MYOPATHY 2; NEM2

Protéine apparentée:NEBULETTE; NEBL

Pathologies associées: en 2015 voir mutations découvertes.