Myosine

INTRODUCTION

Le muscle fut depuis fort longtemps un sujet d’étude largement développé n particulier pour ce qui concerne sa fonction et  les insuffisances mécaniques observées chez l’homme. On va analyser progressivement divers processus enzymatiques au niveau  musculaire. Puis progressivement on va enregistrer les performances contractiles du muscle. On tentera de comprendre le phénomène de l’atrophie musculaire puis de mieux analyser le rôle de l’influx nerveux dans la fonction contractile ainsi que la vascularisation et l’apport énergétique et la consommation d’énergie qui accompagne les performances contractiles d’un muscle. En fait la composition du muscle en protéines va permettre de donner un nom à plusieurs de ces constituants protéiques et grâce à des méthodes de dosage des protéines d’en évaluer la présence respective comme par exemple pour l’un de ces constituant  la Myosine. C’est ainsi que la Myosine fut définie comme une protéine cytoplasmique qui représente le  composant majeur du filament épais que l’on trouve dans la fibre musculaire.

La Myosine

Répertoire séquences des chaînes lourdes de Myosine

Progressivement des informations complémentaires de séquences permirent d’identifier de nombreuses protéines que l’on va isoler de différents muscles. Si l’on parle bien de Myosine il va très rapidement être découvert que cela concerne un assemblage de diverses entités que l’on va définir comme étant d’une par une protéine relativement importante en taille que l’on va définir comme étant la chaîne lourde de myosine (Heavy Chain =HC) et dont les particularités sont indiquées dans le premier Tableau suivant.

répertoire des chaînes Légères de MyosineD’autre part on va découvrir le présence d’entité plus courte que l’on baptise alors comme étant les Chaînes légères de Myosine (LC=light Chain). Par ailleurs on va identifier différentes isoformes de chaînes lourdes de myosine aussi bien dans le muscle strié squelettique, cardiaque et même dans le muscle lisse. Les isoformes de muscle strié squelettique furent associées à une classification par type de myosine rapide (type II) et lente (type I) voir également chapitre les muscles.

Toutes ces particularités sont résumées dans le second tableau avec pour plus de détails des liens Swissprot qui permettent de mieux les connaitre avec un codification spécifique selon le type de chaine et le type de muscle:  P12883;  P12882;  P11055; Q9Y623; P11055 ; P13535 ; Q96A32 ; P08590; P13533; P12883; P10916; P08590; P35749; O14950; P14649.

 À partir du muscle squelettique de lapin il fut possible d’obtenir des préparations de myosine relativement purifiées grâce à l’association d’une extraction à forte force ionique en présence d’un analogue compétitif de l’ ATP non hydrolysable (le pyrophosphate) et de magnésium, puis d’une précipitation par environ 14 volumes d’eau. Finalement après plusieurs lavages à faible force ionique la solution enrichie en myosine fut solubilisée à forte force ionique pour subir ensuite un fractionnement au sulfate d’ammonium 1,6 M.

Ainsi la Myosine va être isolée et alors être définie comme étant  un complexe hexamèrique composé de 2 chaînes lourdes et de 4 chaînes légères qui réalise une structure dissymétrique composée d’une partie bilobée N-terminale branchée sur une partie fibrillaire en forme de bâtonnet. (Voir également d’autres  informations complémentaires sur la myosine et plus généralement sur la contraction musculaire).

Schématique représentation de la MyosineUn portrait-robot général de la Myosine est présenté ci-dessous de manière schématique et avec les nouvelles données acquises selon l’allure dissymétrique mise en évidence avec une partie N-terminale présentant une allure compacte constituée par 2 têtes globulaires et une partie C-terminale en forme de bâtonnet constitué par 2 portions hélicoïdales.

Chaque chaîne lourde est composée d’environ 2000 acides aminés qui réalisent en N-terminal une structure globulaire d’environ 850 acides aminés associée à une zone en alpha hélice rigide pour la partie C-terminale. C’est l’association de 2 chaînes lourdes par leurs parties C-terminales qui réalise une structure en bâtonnet qui se termine alors par 2 têtes globulaires.

Assemblage des divers constituant formant une molécule de Myosine Au niveau des têtes globulaires on trouve également une association avec d’une part une paire de chaînes légères dites régulatrices d’environ 20 kilodaltons (RCL dont la séquence est constituée de 168 résidus) et d’autre part une paire de chaînes légères dites essentielles dont le poids moléculaire varie de 25 à 17 kilodaltons (ECL dont les séquences ont été publiées). On nomme parfois ces dernières, les chaînes légères alcalines. L’ensemble se trouve donc réalisé par l’assemblage d’une part d’une chaîne lourde (HC =Heavy Chain) et de 2 chaînes légères (LC = Light Chain), pour donner une structure nommée « Myosine à 1 tête ». et c’est l’assemblage de 2 entités similaire qui finalement donnera la structure finale de la molécule de myosine comme illustré plus haut. Un schéma récapitulatif donne le détail de cet assemblage hexamèrique ainsi que le bilan du poids moléculaire de chaque constituant ainsi que le PM (poids Moléculaire) total approximatif de la molécule de Myosine.

Par la suite ce sont des étapes de protéolyses limitées qui permirent d’obtenir des fragments stables de myosine. Pour cela deux conditions furent élaborées

1) En présence de magnésium

On obtient alors comme indiqué sur l’illustration ci-dessous, la génération d’un fragment de la partie bâtonnet, soit la Méromyosine légère LMM (L pour Light) d’une part  et la Méromyosine lourde HMM (H pour Heavy) d’autre part ce qui correspond à une mini-myosine avec une courte partie en bâtonnet terminée par les 2 têtes globulaires. Il y a alors protection de la région charnière du bâtonnet et de la partie globulaire par les chaines régulatrices en présence de  magnésium et/ou de calcium  envers la protéolyse limitée réalisée par la Chymotrypsine. 

2) En présence d’un chélateur de métaux l’EDTA

On réalise, toujours via une protéolyse limitée avec comme enzyme la chymotrypsine mais avec la présence de l’acide éthylène-diamine-tétraacétiqclivage protéolytique par la Chymotrypsine de la molécul de Myosineue (EDTA), comme cela est indiqué dans le schéma suivant, une dégradation des chaines régulatrices et une attaque au niveau de la charnière qui partage le HMM en deux sous-fragments : a) le « S2 » la partie bâtonnet constituée de 2 courte chaînes lourde associées, et b) les « S1 » où têtes globulaires de myosine libres. Chaque S1 est composé alors par une chaîne lourde d’environ 95 kDa associée avec seulement une chaine légère de type alcalin (ou également dite chaîne légère essentielle). Ceci est vrai avec la plupart de protéases utilisées cependant avec une solution de papaïne pour réaliser un autre type de protéolyse limitée de la Myosine,  il a été possible d’obtenir la chaîne lourde de la tête globulaire de myosine  (environ 97 kDa) associée avec ses deux types chaines légères intactes (RLC et ECL).

Grâce à la relative insolubilité des parties en bâtonnets de la molécule de myosine, fractions LMM où S2 et à la grande solubilité sans force ionique des têtes globulaires de myosine (fractions S1) on a finalement facilement su isoler ces dernières. Après clivage par la chymotrypsine on peut isoler du S1 stable. Des analyses biochimiques pour mieux identifier le rôle et la fonction de la tête globulaire de myosine sont alors réalisées. Il fut alors établi que les chaines légères, la liaison avec le nucléotide et la liaison avec l’actine concernait uniquement le S1 où tête globulaire de myosine.

Susceptibilité protéolytique de la chaîne Lourde du SF1 chymotrytiquePuis une large panoplie de protéases ayant des spécificités bien différentes (voir travaux correspondants) donna naissance à des fragments stables mais inséparables sans perte de fonctionnalité, mais pour lesquels on a pu investir du N au C-terminal de la chaine lourde du S1 (PM = 95 kDa) l’ordre séquentiel des fragments protéolytiques obtenus, puis leur relation respective avec soit le nucléotide, soit avec les chaines légères ou avec l’actine. Puis on a pu déterminer la séquence primaire de la tête globulaire de myosine en isolant et en analysant progressivement le fragment 20 kDa puis le fragment 50 kDa et le fragment de 27 kDa référencé 25 kDa.

Cependant grâce de nouveau à l’utilisation de la protéolyse limitée non plus sur une préparation de S1 obtenu avec la chymotrypsine mais sur un complexe stable réalisé entre l’Actine-FProfil protéolytique de la chaîne lourde du SF1 en présence de F-actine et le S1 une nouvelle information importante a été obtenue sur l’association actine-myosine et sur la zone protégée de l’attaque enzymatique suite à cette association forte. La zone de contact était alors mieux définie au niveau de la chaîne lourde du S1 de myosine. (Voir illustration suivante et résultats originaux)

Ainsi les 3 fragments du Séqeunce primaire du SF1 tryptique de la Mysosine MYHC7N- au C-terminal nommés 25-50-20 kDa et la présence de 2 séquences de connexion particulièrement sensibles aux protéases (1) et (2), dont la région (2) étaient spécifiquement protégée par l’interaction avec l’Actine-F. (Voir séquences des régions de connexion entre les fragments 25-50-20 kDa du S1 chymotryptique de Myosine lente obtenu après protéolyse avec la trypsine).

représentation spatiale du SF1 chymotryptiqueAinsi du N au C-terminal de la tête globulaire cette nomenclature demeura lorsque le cristal de S1 fut finalement obtenu. (Voir référence correspondante). Et on identifia le S1 comme le domaine moteur de la myosine qui possédait l’activité ATPasique activable suite à l’association avec l’Actine-F.

On identifia le S1 comme le domaine moteur de la myosine qui possédait trois sites essentiels à la fonction de la myosine, le site d’association des chaines légères, le site nucléotidique et le site d’interaction avec l’Actine. Cela avec une grande flexibilité de l’ensemble et une activité ATPasique activable suite à l’association avec l’Actine-F. (Voir illustration ci-contre et chapitre suivant pour la conversion de l’énergie chimique en énergie mécanique au sein de la tête globulaire de myosine).

Relation de la Myosine avec les pathologies

L’évolution des connaissances a permis de confirmer qu’il n’existait aucune relation entre les parties codantes du gène (exons) et les fragments protéolytiques de la tête globulaire de myosine. Une analyse spécifique a concerné la partie globulaire de la Myosine et des potentielles mutations ayant un impact sur la fonction. En particulier on observe des altérations soit de la fonction motrice, hydrolyse de l’ ATP défectueuse et perte des performances contractile du muscle, et/ou altération d’une bonne reconnaissance de l’Actine.   On observa cependant que certains codons étaient particulièrement la cible de mutation (cas du résidu 403 par exemple) tandis que des exons entiers ne possédaient pas de mutation associée à une pathologie (voir les études en 1992 sur les  diverses mutations déjà répertoriées à cette époque).

Une étude détaillée sur des protéines recombinantes contenant ce résidu Arginine 403 (R403Q) permet de mieux identifier l’impact d’une telle mutation sur la conformation du site de liaison à l’actine. Ce travail est complémenté par des études avec des peptides de synthèse de la même région. Pour autant l’effet de cette mutation  (R403Q)apparait comme fonctionnellement différent si la myosine concernée est de type Alpha ou de type Bêta.Une autre expérience avec une souris transgénique permet de démontrer des différences cinétiques selon l’isoforme  (alpha ou bêta) affectée par cette mutation (R403Q)

Par ailleurs, l’importance de la faille au sein du domaine de 50 kDa permet de réaliser de nombreuses études sur la structure-fonction du domaine moteur de la myosine. Le détail de plusieurs mutations au sein du site de reconnaissance de l’actine figure dans l’article en référence. Un autre travail important montre que la zone de connexion entre les domaines 50 et 20 est riche en Lysine et que le fait de rajouter une tel résidu augment son affinité pour la molécule d’actine.

Distribution des mutations sur la chaine lourde du SF1 tryptiqueDans l’illustration suivante le schéma résume l’ensemble des mutation qui concerne seulement la partie globulaire dite tête de Myosine (SF1) avec quelques mutations proche de la jonction avec la partie en bâtonnet. Le schéma suivant indique les mutations en relation avec les domaines 25, 50 et 20 du SF1 fragmenté par la trypsine dont le C-terminal est écourté par rapport au SF1 obtenu par la Chymotrypsine.

Par ailleurs de nombreuses mutations furent également découvertes sur la partie en bâtonnet de la myosine. Les études sur la Myosine de Drosophile confortent ces résultats. Ces mutations et leur impact sur le conformation de cette structure est relativement dépendante du type de mutation (Cas du résidu  R1500  et sa mutation en P et/ou W et le changement de conformation).

Récentes mises à jour depuis fin 2011

Le classement des différents types de fibre musculaire chez les mammifères est mis à jour dans l’article de synthèse présenté ci-dessous. (voir schémas). Un bilan des mutations affectant les protéines musculaires est disponible actuellement. En particulier cette revue considère les altérations qui concernent les Cardiomyopathies Dilatées.

La technique dite « High-speed atomic force microscopy = HS-AMF) permet de mieux comprendre actuellement la conversion d’une énergie chimique au niveau d’une ATPase comme la F1-ATPase par exemple. Les applications sur les Myosines peuvent également être envisagées (voir étude sur la Myosine de type V par exemple).  Sans compter les multiples applications de cette technique sur les divers systèmes Biomoléculaires.

Une récente revue aborde les effets du calcium et des ions phosphores dans le développement des problèmes Cardiovasculaires.  Couplage excitation-contraction et le cycle du calcium intracellulaire dans les cœurs défaillants. Dans cette autre revue, en 2013 il est décrit le processus général de l’hypertrophie musculaire et de la régénération de ce muscle. Dans le détail sont  décryptées les interactions entre les deux groupes de facteurs impliqués dans le processus. Différents mécanismes sont proposés pour soutenir ces interactions

 

Myosines non-musculaire et progression tumoraleEn 2014 une nouvelle étude aborde la topologie de la myosine nucléaire sur la base d’une activité  motrice basée sur l’Actine et la façon ce moteur  est censé faciliter la propulsion de l’ARN polymérase, tout en maintenant la chromatine dans un état  compatible avec la transcription. Ces mécanismes seront placés dans le contexte de la progression du cycle cellulaire. Par ailleurs les Myosines dites « Non-musculaires » de type II sont des protéines motrices (myosine IIA, myosine II B, et la myosine IIC) qui appartiennent à une classe de protéines assimilés à des moteurs moléculaires qui sont connus pour la transduction libre de l’énergie cellulaire pour un travail biologique plus efficace que les moteurs à combustion par l’homme. Cette étude indique que le fait de ne posséder qu’une seule tête globulaire est compatible avec une fonctionnalité correcte. Par contre, une autre publication indique l’état actuel des connaissances sur la façon dont les mutations ou les changements épigénétiques dans les gènes codant pour la Myosine, tout comme les changements dans l’expression de la Myosine, peuvent affecter la progression d’une tumeur cancéreuse.  Les résultats obtenus chez des patients permettent d’examiner les mécanismes proposés reliant inactivation de la Myosine et/ou la régulation positive du phénotype malin, la migration des cellules cancéreuses et les métastases. Une représentation schématique de certaines des fonctions qui ont été proposés pour les différents membres de la superfamille des Myosine pendant la progression tumorale et les métastases est représenté ci-contre issu directement de l’article en référence..

Mais des travaux originaux indiquent le rôle précis des Myosines dites « Non-musculaire » dans le développement de différentes pathologies humaines. Des avancées sur la compréhension de l’action de la Myosine dans la contraction et sa relation avec la création du mouvement s’appuient sur de nouvelles techniques utilisant la fluorescence. Sur ce champ d’investigation un travail spécifique mettra l’accent sur la haute résolution des techniques de suivi de fluorescence au niveau des moteurs du cytosquelette que sont en particulier  les Myosines. De nouvelles informations sur l’ensemble des mutations connues sur la totalité de la structure de Myosine sont mises à jour dans l’article en référence.

Une nouvelle analyse indique que chez les humains adultes âgés, il existe des adaptations des myofilaments de muscle squelettiques avec le vieillissement, la maladie, et  la désuétude. Ce travail rapporte également les effets sur la performance du muscle en général en relation avec l’âge du patient. Par ailleurs une autre analyse rapporte les évolutions et les avantages en relation avec les réseaux de filaments de Myosine dans les muscles striés vertébrés. De nouvelles données démontrent l’existence d’une différence de susceptibilité lésionnelle  selon le type de myosine lourde (variation dans l’isoforme de la chaîne lourde HC),  au cours de contractions  excentriques-induites.

De plus il est possible avec diverses technologiesincluant le marquage fluorescent  et un microscope performant de suivre le déplacement de la myosine sur un filament d’actine comme le montre les vidéo relatives à l’article en référence.

En 2015 pour ce qui concerne chez les mammifères les différents types de Myosines non-musculaire (Myosine de type II) ce travail rapporte les propriétés quant au possible co-assemblage ainsi que ce qui concerne les diverses régulations possibles. Ce nouveau travail indique le modelage cardiaque et le type d’entraînement physique nécessaire après un  infarctus du myocarde.

Modèles de conformation des Myosines non-musculaireUn bilan fait état du rôle et de l’importance de la  Myosine-X (Myo10)  en relation directe avec les pathologies observées.  L’allure général de cette Myosine particulière est illustrée ci-contre ainsi que la possibilité pour former un monomère inactif mais également 2 type de dimères parallèles et/ou antiparallèles dont le processus de mise en place est encore à analyser et nécessite de plus larges investigations.

En ce qui concerne plus particulièrement la Myosine de type IIB son rôle précis dans la polarité cellulaire est analysé dans ce travail et résulte seulement d’une faible portion de la molécule. On observe en effet en rapport avec le front de migration d’une cellule comme la cellule mésenchymateuse un gradient inverse pour la distribution des isoformes dite NMII-A et  NMII-B.  Cette revue examine en détail les agents qui modulent la fonction mécanique du sarcomère. En se concentrant sur des composés émergents qui ciblent la Myosine et/ou le complexe des Troponines ce travail permet d’avoir une vue d’ensemble sur la fonction correcte du muscle au niveau d’un sarcomère.

Cycle simplifié de l'hydrolyse de l'ATP par la tête glogulaire de MyosineUne analyse précise de la tête globulaire de Myosine indique que le domaine dit 50 kDa se trouve divisé en 2 partie distincte qui forme les 2 lèvre d’une fente au sein de laquelle se trouve le centre moteur de la molécule (Activité ATPasique), tandis que le domaine 20 kDa lui se trouve avec le rôle important de convertisseur de l’énergie chimique (clivage de l’ ATP en ADP et P) en énergie mécanique permettant finalement la migration d’une tête globulaire de myosine d’une Actine globulaire vers sa voisine . un schéma récapitulatif présenté ci-contre résume l’ensemble de ces données.Tout ce processus s’accompagne de changement de conformation bien spécifique au sein de la tête globulaire de Myosine.

 

Des données importantes résultent des analyses sur le domaine dit moteur de la tête globulaire de myosine avec l’implication spécifique de certains résidus au cours du cycle ATPasique de l’hydrolyse par la myosine de l’ATP.

La contraction musculaire et le rôle de l'Actine la Myosine et la TitineIl est proposé dans ce nouveau travail  que la contraction musculaire implique non pas 2 mais 3 types de filaments : l’Actine, la Myosine et  aussi la Titine. C’est en fait la Titine qui serait capable de réguler  la force par sa capacité à fixer le calcium et en agissant avec sa capacité à raccourcir la longueur du ressort qui lui permet de se lier à l’actine. Un schéma récapitulatif montre comment un tel processus prendrait place au cours de la contraction musculaire et la position de la Titine dans sa relation avec d’une part l’Actine et d’autre part la Myosine.

En conclusion

Pour suivre l’évolution des connaissances sur chaque membre de la famille des Myosines il existe des banques de données récentes qui sont  automatiquement mises à jour qui répertorient :

A)      Chaque isoforme de Myosine avec son lot de références historiques. Ici juste une référence sera donnée car les mutations concernent aussi bien les Myosine rapides, Lentes, cardiaques et non-musculaire. De plus cela est parfois en relation avec la chaine lourde de myosine parfois avec l’une des chaines légères.

B)      Les principales maladies actuellement connues qui résultent d’une mutation ou d’un défaut dans la protéine considérée (avec des références associées).

Protéines : Les MYOSINES

******   Il y a en fait plus de 317 types de gènes impliqués et ici sont indiqués 2 exemples :

1)      Protéine :  MYOSIN, HEAVY CHAIN 2, SKELETAL MUSCLE, ADULT; MYH2 

Pathologies associées: INCLUSION BODY MYOPATHY 3, AUTOSOMAL DOMINANT; IBM3

2)      Protéine : MYOSIN, HEAVY CHAIN 7, CARDIAC MUSCLE, BETA; MYH7

Pathologies associées:CARDIOMYOPATHY, DILATED, 1S; CMD1S ; MYOPATHY, DISTAL, 1; MPD1 ; MYOPATHY, MYOSIN STORAGE