Dystrophine (Nouveautés)

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Introduction

Chacun des 4 chapitres précédents sera mis à jour si l’information est relative au chapitre considéré, par contre les découvertes concernant 2 thèmes particuliers seront réunies pour permettre un accès rapide aux avancées nouvelles. Nous présentons ici depuis les années 2010 d’une part des nouvelles approches pour une Aide au Diagnostic Clinique de la maladie, et d’autre part les Découvertes Fonctionnelles en relation avec toutes les nouvelles connaissances sur une meilleure compréhension du rôle et de la fonction de la Dystrophine en général et plus particulièrement dans le muscle, ce qui de près ou de loin peuvent avoir une influence sur une meilleure interprétation du stade évolutif de la maladie chez chaque patient.

NB : Cette fiche rapporte les données d’aide au diagnostic et des nouveautés fonctionnelles récentes mais le recherche progresse chaque jour et 2 chapitres additionnels figurent sous le titre respectif de : « Recherches Fondamentales Récentes » et« Applications Récentes chez l’homme » qui seront mise à jour régulièrement


Aide au Diagnostic Clinique

L’ensemble des données réunies dans ce chapitre sont toutes en relation directe et unique avec la pathologie DMD chez l’homme, les donnes concernent directement le patient DMD et sont susceptibles d’apporter une aide au diagnostic pour le clinicien qui rencontre des cas particuliers. L’ensemble de ces données ne concerne que la période depuis 2010 jusqu’à nos jours.

Plusieurs MicroARN (=MicroRNA) qui se retrouvent dans le sang peuvent être dépistés, chez la souris ou le chien déficient en Dystrophine. Parmi ces Micro ARN qui sont spécifiques du muscle,  on trouve plus particulièrement une augmentation des formes  dites miR-1, miR-133a  et miR-206. De manière très intéressante, et cela contrairement au taux de CK (créatine Kinase) dans le sérum  le taux de ces différents miARNs ne sont trouvés que peu modifié après un exercice des animaux sur un tapis roulant. Ces résultats suggèrent que les miRNAs  présents dans le sérum sont des biomarqueurs utiles et fiables pour diagnostiquer une  dystrophie musculaire. De plus, on trouvera dans l’article indiqué (Juillet 2011) une corrélation entre l’âge du patient et des altérations cardiaques en relation avec la Dystrophine. Consulter également une Revue parue en Aout 2011 sur la pathophysiologie et la thérapie de la dysfonction cardiaque chez le DMD. Mais une nouvelle méthode pour mieux détecter les erreurs et/ou mutations qui conduisent aux pathologies dites DMD et BMD conduit à une utilisation plus simple des récentes technologies mises en place aujourd’hui. Cette approche permet une recherche totale des potentielles mutations du gène DMD à l’aide d’une plateforme unique (voir détails dans cet article). Ainsi en 2011 si chez le chien dystrophique, même dans son jeune âge il existe des changements dans les enregistrements de son électrocardiogramme  comme dans celui de son échocardiogramme  qui sont susceptible de révéler l’absence de la Dystrophine.  Il faut savoir que maintenant de telles anomalies sont confirmées dans  l’enregistrement de l’électrocardiogramme chez le jeune enfant DMD

cascade de signalisation de la mort cellulaire chez le patient DMDUn nouveau cas d’un patient Becker avec une cardiomyopathie précoce est rapporté en Octobre 2012. Puis en Novembre 2012 une revue bilan propose de donner l’état des lieux sur  les approches génétiques et médicales de Dystrophinopathies. Ce travail propose un  diagnostic génétique moléculaire et son impact sur la pratique clinique. La Myopathie  Cardiaque chez les patients Duchenne/ une analyse cellulaire et un travail de recherche  sur les voies de signalisation impliquant le calcium dans le cas particulier du cœur. (Voir aussi l’illustration colorée et didactique de la figure N°2). Les voies de signalisation du calcium et des agents ROS/RON sont mis en évidence dans la schéma suivant en référence à l’article indiqué plus haut.

détermination de la quantité de Dystrophine dans un extrait musculaireUne nouvelle étude propose une évaluation précoce du développement des défauts neurologiques chez les patients DMD (études sur 81 jeunes enfants âgés de 7 à 47 mois). De nouvelles analyses bio-informatiques ont été réalisées sur divers point de mutation du gène DMD. Cela conduit à des algorithmes nouveaux capables de prédire les conséquences sur le mRNA résultant et diverses possibilités d’épissage alternatifs (Voir détails et tableaux de l’article indiqué). Un nouveau dosage à faire dans l’urine de patients DMD. En effet ce nouveau travail indique qu’un métabolite de la prostaglandine D2 est retrouvé relativement concentré dans l’urine des patients atteints de Dystrophie Musculaire de Duchenne. Ce résultat est important car en effet ce dosage présente  une augmentation régulière en particulier chez les patients âgés de plus de 8 ans. Une nouvelle quantification précise des protéines dans le muscle squelettique humain par spectrométrie de masse. (Application valable pour le dépistage de la Dystrophine).

Une revue du découvreur de la Dystrophine (Louis KUNKEL) fait le point sur les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à une Dystrophie Musculaire. (Voir en particulier le schéma didactique de la Figure N°1, avec la distribution respective de la Dystrophine, de la Dysferline et de l’ Intégrine).  Les dystrophies musculaires de Becker et de Duchenne:  Un processus d’information dans les deux sens pour les thérapies. Le diagnostic moléculaire des Dystrophinopathies à l’aide d’un algorithme d’analyse multi techniques. Une autre étude (décembre 2012) démontre que même un faible taux de Dystrophine exprimée dans le muscle permettrait de combattre la relative raideur d’un muscle déficient de souris. De plus même une Dystrophine tronquée semble apporter son lot de bénéfice à un tel muscle malade.

comparative évolution du test de la marchePuis en 2013, une  analyse fait le bilan des Considérations cardiaques dans la méthodologie d’approche  du patient avec soit une Dystrophie musculaire de type  Duchenne soit de type  Becker. Le cas potentiel d’une  cardiomyopathie dilatée chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et Becker n’est pas en corrélation avec un peptide natriurétique cérébral  (voir détails dans l’article en référence). Être de petite taille serait un avantage si on est atteint de La pathologie DMD. Cette analyse semble proposer d’inhiber les facteurs de croissance chez l’homme pour limiter les effets de l’absence de Dystrophine, axe de thérapie à considérer ? un test de la marche démontre ce point (voir schéma et détails dans l’article indiqué).Il est fait mention que le mécanisme de la Sensibilité Ventilatoire aux produits chimiques est émoussée chez le modèle de souris mdx de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), comme cela est rapporté dans un article récent. Caractérisations biochimiques des patients atteints  d’une Dystrophie musculaire résultant d’un épissage alternatif en phase ou hors-cadre de lecture affectant plus  particulièrement le saut d’exons 44 ou 45.

Toujours en 2013, le bienfondé de la réalisation d’une biopsie musculaire chez l’enfant permet de dresser un diagnostic rapide. Bilan pharmaceutique des approches thérapeutiques chez les patients atteints de diverses Dystrophies musculaires Les  données,  contenues dans l’article en référence, confirment la présence de l’immunité préexistante en circulation des cellules T vis-à-vis de la Dystrophine. Cette présence d’anticorps anti-Dystrophine existe   dans une proportion importante chez les patients atteints de DMD, Ce point est à souligner et indique impérativement la nécessité d’en tenir compte au cours d’une mise en place des essais de thérapies géniques cliniques et donc aussi dans l’interprétation des résultats. Puis un article indique en Octobre 2013 un bilan sur : Croissance et développement psychomoteur des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne. Une autre étude rapporte l’ ‘analyse des gènes exprimés de manière différentielle dans les différentes étapes de la dystrophie musculaire de Duchenne en utilisant une vue de réseau internet. Dans cet article on accède à une approche rationnelle liée à la thérapeutique qui consiste à remplacer la Dystrophine dans les muscles des patients, en répondant ainsi à l’anomalie biochimique primaire. L’article présente un répertoire sur le développement de médicament orphelin dans la dystrophie musculaire.

En 2014, pour encore mieux détecter la Dystrophine chez l’homme mais aussi chez les animaux modèles comme le chien et le chat, de nouveaux anticorps sont disponibles et bien ciblés (voir détail dans l’article en référence, parmi 65 anticorps il en existe 15 qui donne une réponse chez le chien). Une  autre mutation de la Dystrophine est nouvellement décrite et conduit à une Dystrophine tronquée est nouvellement découverte  chez un patient atteint d’une dystrophie musculaire de type Becker, est responsable d’un  début précoce de Cardiomyopathie Dilatée Une  revue sur la thématique des dystrophies musculaires de types Duchenne (DMD) et/ou Becker (BMD). Une mutation “nonsense” est découverte au niveau de la Dystrophine avec un muscle sans Dystrophine mais un profil moins sévère que la normale. Relation entre le type de mutation et la sévérité de développement de la pathologie Duchenne/ Becker (Une mise à jour). Le rôle de la Dystrophine  (Muse à jour en 2014) dans la  population générale en ce qui concerne l’apprentissage Une nouvelle  méthode très sensible et reproductive pour analyser à l’aide de la microscopie en fluorescence et sur une seule fibre musculaire d’un patient DMD,  la présence potentielle de Dystrophine. Les protéines impliquées normalement  comme marqueurs du système inhibiteur synaptique au niveau de l’hippocampe se trouvent mal localisé chez la souris déficiente en Dystrophine. Potentielles implications dans la perte de la capacité d’apprendre chez le patient DMD. Le diagnostic Moléculaire de la Dystrophie de Duchenne (DMD, revue en 2014). Une méthode par les ultrasons pour évaluer la détérioration musculaire chez le patient Becker (voir dans l’article en référence). La sévérité de la pathologie Becker est directement liée au type de troncation dans la structure finale du produit de la  Dystrophine résultant de l’épissage. Détermination de la quantité de Dystrophine exprimée : Analyses biologiques et implications. Le bilan actuel sur les stratégies de thérapies Moléculaires expérimentales est prometteur pour traiter efficacement les patients atteints de Cardiomyopathie dépendante de l’absence de Dystrophine. Une nouvelle  étude présente en détail,  la comparaison entre l’expression  de l’acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) et du carbohydrate dans les cellules  T cytotoxiques (CT) au sein des cellules musculaires déficientes en Dystrophine, chez le chien et chez l’homme. Une avancée non invasive de la DMD : dépistage de fragments de Titine dans l’urine.

Activation temporelle des HDACsEn 2015, une revue sur le Spectre des Dystrophies musculaires résultant d’anomalies génétiques associées à des protéines sarcolemmiques. Un schéma didactique résume le processus de la régénération potentielle d’un muscle par rapport avec la mise en place progressive de la fibrose dans un muscle déficient en Dystrophine comme cela est repris dans l’illustration ci-contre.

Analyse d’une Cardiomyopathie dilatée précoce et progressive chez une famille avec une dystrophie musculaire de Becker liée à une mutation du cadre de lecture du gène codant pour  la Dystrophine au niveau de l’exon 27. Cette nouvelle étude permet d’établir  une forte corrélation entre les effets de contractions excentriques sur les muscles du membre inférieur et sur ceux stimulés au cours  de la marche avec  les taux de graisses musculaires présentes. (Voir le schéma et le détail des calculs dans la référence indiquée.) Les corrélations  entre génotype-phénotype au niveau de la Dystrophine  cardiaque chez le myopathe Duchenne et/ou Becker sont étudiées dans ce travail. On parle de l’utilisation de l’imagerie cardiaque à l’aide de la  résonance magnétique (MRI). Une nouvelle analyse du profil Enregistrements non-invasifs des dommages musculairescognitif et des processus neurocomportementaux chez les garçons atteints dystrophie musculaire de Duchenne. La Dystrophine et son rôle dans la Dystrophie musculaire de Becker avec impact sur la sévérité de la pathologie.

Un autre article traite de la question: Comment  expliquer la dégénérescence musculaire sélective dans la dystrophie musculaire de Duchenne? La méthode utilisée est résumée par un schéma présenté ci-contre ou l’on indique 2 tests non(invasifs pour évaluer la performance contractile d’un muscle malade

Une autre méthode pour suivre le traitement d’un muscle malade par un test MRI (Magnetic Resonance Imagery), consulter l’article en référence pour plus de détails.

Spectre des pathologies associées au DAPCDans l’actualité récente des revues sur le complexe formé autour de la Dystrophine accrochée au sarcolemme au sein de la fibre musculaire un schéma résume les connaissances qui chez l’homme ont été clairement identifiées avec le spectre des pathologies musculaires directement en rapport avec l’une des protéines constitutives du large complexe macromoléculaire formé par la Dystrophine et toutes les protéines associées.

L’apprentissage associatif sous la dépendance  cérébelleuse est préservé dans la Dystrophie Musculaire de Duchenne (Voir détail sur la méthode utilisée dans l’article en référence).

En 2015, description  d’un sujet masculin âgé de 32 ans avec une rhabdomyolyse récidivante en raison d’une Dystrophinopathie (Avec un Dystrophine dont la  partie centrale est manquante) , se trouve finalement avec  la force normale et seulement un taux de CPK légèrement surélevée, imitant myopathie métabolique.

Une stratégie utilisant des Virus recombinants ayant une expression éphémère est actuellement évaluée dans  le muscle dystrophique avec une étude  des dommages oxydatifs en corrélation avec l’ARNm du transgène. Une nouvelle étude indique la Caractérisation clinique et génétique d’un cas de patient féminin avec une  Dystrophinopathie

Une nouvelle étude indique la Caractérisation clinique et génétique d’un cas de patient féminin avec une  Dystrophinopathie.  Un nouvel article propose une Analyse des régions hydrophobiques de la Dystrophine et leur importance dans les pathologies de Duchenne et de Becker. Plusieurs schémas indiquent avec la couleur verte les hélices hydrophobiques distribuées dans la zone N-terminale, dans certaines séquences répétitives centrales et dans la région riche  en Cystéines. Des commentaires accompagnent ces constats en rapport avec les pathologies résultants de Dystrophines plus ou moins altérées. Les auteurs attirent l’attention sur le fait que les changements mutationnels qui interviennent plus particulièrement dans une structure hydrophobique, de chaque région de la Dystrophine ici étudiée dans leurs investigations, semblent jouer un rôle important dans la sévérité de la pathogenèse observée chez des patients atteints de DMD.

Nucléotides modifiés pour des oligonucléotides antisensLes avancées en thérapie Géniques nécessitent de plus en plus de nouveaux oligonucléotides antisens. Le bût étant lorsque cela est possible de provoquer un épissage ciblé sur le gène codant pour la Dystrophine de manière à sauter la zone non conforme pour donner une protéine intacte. Si les nucléotides modifiés sont de plus en plus nombreux,  (voir chapitre nouveauté) on peut consulter un travail sur leurs utilisation dans la fabrication d’ oligonucléotides antisens. Un schéma directement issu de ce travail donne un aperçu des divers nucléotides chimiquement modifiés qui sont actuellement utilisés.

Dès 2014, des biomarqueurs de protéines sériques ont été recherchés  dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) comme susceptible de refléter la pathogenèse de la maladie, sa progression et ainsi faciliter les évolutions futures de potentielle  thérapie.  Un taux élevé de protéines pour la plupart d’origine musculaire a été trouvé en particulier des fragments provenant de la Titine, les chaîne légères 1 et 3 de la Myosine, la Myomésine-3 et la Filamine-C, mais également des enzymes glycolytiques comme l’ Aldolase, la Phosphoglycérate mutase  de type 2, l’Énolase and la Glycogène, Phosphorylase  tout comme des proteins de transport comme la Protéine de liaison des acides gras, la Myoglobine, le Cytochrome-C et d’autres entités comme la créatine Kinase-M, la Malate Déshydrogénase, le Fibrinogène et la Parvalbumine. Ceci fut confirmé chez la souris et chez l’homme cependant en 2015, un nouveau test important pour détecter la pathologie DMD mais également d’autres types de myopathies semble  de doser plus spécifiquement  la concentration pour les fragments de Myomesin-3 (MYOM3) dans le sérum de ces patients. On trouve en effet 2 fragments majeurs de cette protéine MYOM3 avec un poids moléculaire respectif de 100 et 130kDa , de tels fragment semblent beaucoup plus  sensibles que ne l’est le dosage  de la CK pour une détection chez les patients DMD au début de la pathologie ou suite à un effort musculaire , mais également pour un suivi durant une procédure de thérapie visant à restaurer le complexe Dystrophine-protéines associées.  Ainsi la détection des fragments de MYOM3 sont  désormais à considérer comme de très bons  biomarqueurs pour le suivi, la  détection, l’évaluation et le traitement de la DMD, de la LGMD2D et potentiellement pour d’autres formes de dystrophie musculaire associés à une augmentation du renouvellement des protéines sarcomériques. Pour cela il faut utiliser un anticorps spécifique dirigé contre la séquence   887 à 1178 de la Myomésine de type 3 qui en Western blot détectera les 2 bandes de protéines de  100 et 130 kDa respectivement avec l’utilisation d’un anticorps anti-MYOM3 (1:1000, Proteintech: 17692-1-AP) en comparaison avec l’anticorps anti-CK-M (1:500, Santa Cruz: sc-15161). Une autre analyse compare et enregistre les différences significatives dans le profil des protéines sériques trouvées dans divers sera. Pour ce qui concerne la DMD il y a dans plus de 70 % des cas une augmentation significative pour L’ALanine aminoTransférase (ALT avec 97,5% des cas) pour L’ASpartate aminoTransférase (AST, dans 97,5% des cas) et La Lactic DeHydrogénase (LDH dans 97,5% des cas) mais pour la Créatine Kinase (CK dans 100% des cas. Voir l’article en référence pour plus de détails

Progression dune déficience en Dystrophine-protéines associéesLes analyses  biochimiques et fonctionnelles de 2 types de  Dystrophies musculaires en comparant d’une part chez la souris mdx (absence de Dystrophine) et d’autre part chez la souris Sgcg (absence de la forme Gamma du Sarcoglycane). Un schéma récapitule les divers stades de l’évolution de telles pathologies et illustre avec des méthodes adaptées diverses étapes permettant de bien visualiser par exemple soit les cellules musculaires soit l’inflammation cellulaire, soit la fibrose l’apoptose, et/ou le collagène.

Exemple de thérapie par saut d'exon (cas de l'exon 45 de la Dystrophine)Cette nouvelle étude publiée en Juin 2015 montre sur plus de 300 cas  de thérapie chez des sujets japonais atteints de la pathologie DMD en utilisant la stratégie de divers sauts d’exon exons, 19, 27 et 45),  via des Oligonucléotides Antisens (AO). Parmi de nombreux autres cas une illustration présentée ci-dessous montre comment le cas d’une mutation altérant l’exon 44 et de fait ne permettant pas un cadre de lecture correcte entre les exons 43 et 45 avec une élimination ciblée de  l’exon 45 il peut être généré l’expression d’une Dystrophine plus courte suite à un cadre de lecture 43-46  fonctionnel.

La spectrométrie dite «Label-Free Mass »  permet de déterminer les mêmes biomarqueurs comme des Biomarqueurs universels des dystrophies musculaires par sectrométriereporters de références dans divers  cas de dystrophies musculaires. Dans ce travail il apparait que le taux d’expression de diverses protéines telles  la Vimentine, les Annexines et les Laminines spécifiques de chaque type de muscles sont toujours trouvée augmentés ce qui en fait des biomarqueurs universels de ces pathologies. La technique mise en place pour obtenir ce résultat  est décrite en détails dans la référence indiquée et un   tableau récapitulatif indique selon le muscle étudié les variations du taux de nombreuses protéines étudiées dans ce travail comme cela est illustré ci-contre.

Action potentille du resvératrol (couer de souris mdx)Dans ce travail on va trouver de nombreuses informations sur un  Bilan des effets d’un polyphénol présent dans certains fruits comme le raisin (voir formule du  Resvératrol ) et son action activatrice sur la déacétylase SIRT1 (NAD-dependent protein déacétylase sirtuin-1) dans le cas d’un traitement chez la souris  d’une cardiomyopathie dystrophique. Avec cette étude sur le muscle cardiaque déficient en Dystrophine un schéma récapitulatif est proposé et présenté ci-contre légendé en français pour mieux illustrer les possibles vois de signalisations sur lesquels pourrait agir le Resvératrol.

déficit en Dystrophine et conséquences cognitivesUne analyse pertinente du déficit en Dystrophine et ses conséquences sur la déficience cognitive induite. Cet article résume les connaissances actuelles sur des mécanismes, propose des tableaux et des modèles et détermine d’éventuelles stratégies thérapeutiques. La perte de la Dystrophine va induire de nombreux  changements cellulaires. Une Illustration présentée ci-contre montre comment la carence en Dystrophine est susceptible d’induire un raccourcissement des télomères (étape 1)  ce qui provoque la mise en jeu de la voie de signalisation  TGF-β / smad 3  (étape 2) avec une stimulation des récepteurs de TGF via le glucose et les métalloprotéinases  MMP (étape 3). Une activation des récepteurs TGF qui entraîne une accélération du cycle impliquant les protéines RhoGTPase avec un  flux de calcium qui va être perturbé  (étape 4) et cela  va être  à la base d’un métabolisme neuronal perturbé via la protéine CaMK-II.  Bilan Clinique processus de la réponse inflammatoire dans un muscle sans Dystrophinesur des patients DMD particulier, cas de la délétion des exons 45-55

Une nouvelle revue met à jour les connaissances sur les isoformes de Dystrophines,  le complexe Dystrophine-protéines associées au niveau du muscle durant un exercice mais aussi indique avec de nombreux schéma que la Dystrophine possède des rôles non mécaniques au niveau des neuromusculaires comme dans le cerveau.

Analyse détaillée d’une pathologie du système auto-immunitaire dans la myopathie de Duchenne. Un ensemble de résultats indique dans un schéma récapitulatif les défauts rencontrés dans le système immunitaire dans un cas d’absence de Dystrophine au niveau du muscle comme cela est présenté avec une version en français du schéma didactique présenté par les auteurs de ce travail dans l’article original.

Les problèmes neuro-développementaux, émotionnels et comportementaux dans la myopathie de Duchenne par rapport à des mutations du gène de la Dystrophine sont résumés dans une revue de mise à jour sur le sujet avec quelques schémas.

Identification des stades du développement musculaireUne analyse cinétique sur l’ultrastructure musculaire chez le modèle animal C. elegans choisi pour l’étude de la myopathie de Duchenne met en évidence un rôle crucial pour les structures d’ancrage des sarcomères et l’intégrité du sarcolemme dans les premières étapes du processus de dégénérescence musculaire. Une illustration issue de l’article en référence donne les données mises à jour dans l’identification des divers stades développementaux du muscle.

La thérapie de la pathologie DMD fait appel aux adénovirus associés (AVV) avec de nombreuses versions différentes encapsidées. Dans cette revue voir le concept et les illustrations didactiques explicatives. Ce bilan fourni également une bibliographie fournie et facilement accessible voir les liens actifs.

La Myopathie de Duchenne: Du diagnostic à la thérapie, une telle revue propose un arbre décisionnel qui selon les données disponibles permet à l’aide d’une suite de branches OUI / NON d’obtenir une réponse claire sur les conséquences fonctionnelles à attendre chez le patient. Cela permet de s’engager vers une analyse alternative pour le diagnostic et/ou vers une identification définitive de la mutation pour le cas analysé et ainsi de proposer la thérapie la plus adaptée. Il est fait état que l’on a statistiquement des analyses d’altération du gène DMD qui correspondant à 4 grandes tendances soit  65% de délétion, soit 6% de délétions (parfois jusqu’10%), soit 25% de mutations identifiés, et enfin environ jusqu’à seulement 2% de cas de mutations complexes (voir la Figure N°1).

Découvertes Fonctionnelles

L’ensemble des données réunies dans ce chapitre sont toutes en relation directe et unique avec l’évolution de nos connaissances sur la Dystrophine et les protéines qui l’entourent et ceci la plupart du temps dans la cellule musculaire. Des données plus spécifiques concernant des sujets relatifs à la pathologie DMD mais concernant des sujets plus spécifiques comme les animaux modèles et/ou les thérapies seront par ailleurs mis à jour et compilés dans les chapitres correspondants. L’ensemble de ces données ne concerne que la période depuis 2010 jusqu’à nos jours.

En 2010  la revue citée icfait également le point sur le fait que les muscles déficients en Dystrophine révèlent une grande susceptibilité à être abimés suite aux nombreux cycles de contraction musculaire. Cela se traduit par une nette augmentation de la concentration calcique dont l’entrée est favorisée par un type de canaux calciques nommé  SACNSC (stretch-activated cation non-specific channels) dont l’un des gènes candidat est le  TRPC1 . Ces derniers sont activés par les espèces de radicaux libres dits   ROS (reactive oxygen species, dont un représentant est Le peroxyde d’hydrogène ( H2O2 ) et inhibé par une protéine phosphatase le  PP2 , un inhibiteur de la  Kinase de type Src  (voir également sa  structure probable par rapport à un oncogène similaire). Un article peut également être consulté pour mieux cerner la fonction et les implications de ces canaux TRP ( Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily ) et leur impact réel sur la compréhension de ces derniers au niveau du muscle squelettique.

Par ailleurs, le suivi de ce type d’oxydation d’un muscle est particulièrement bien étudié dans un travail sur le  diaphragme déficient en Dystrophine et ses altérations suites à une agression par  l’ acide hypochloreux (HOCl)  qui est un radical libre très réactif de même type que (H2O2) qui est également communément appelé  eau oxygénée . Une vérification complémentaire de la perméabilité membranaire résultant de l’absence de la Dystrophine sera à à corréler avec  le taux élevé de calcium intracellulaire et le rôle important des espèces réactives de l’oxygène en référence au travail de recherche indiqué ici. Pour autant les travaux se multiplient pour indiquer que toutes les stratégies envisagées auront leurs limites car il n’y a pas 1 muscle squelettique mais des Muscles squelettique dont l’atteinte peut être totalement différente. C‘est le cas par exemple du stress oxydant qui est particulièrement important au niveau des muscles masticateurs de la souris, mais aussi pour les muscles extraoculaires qui sont particulièrement protégé de l’impact crée par l’absence de Dystrophine et le profil des autres protéines présentes dans un tel muscle est maintenant disponible.

isolation et identification des protéines musculairesMais comme dans toute recherche en général, les connaissances progressent et en particulier dans les maladies musculaires de nouvelles perspectives apparaissent avec  la Protéomique. C’est un vaste domaine qui fait ses preuves chez l’animal. Ainsi on va avoir avec l’approche protéomique, une bonne idée des défauts au niveau du complexe des protéines associées à la Dystrophine en particulier si cette analyse est couplée avec une étape de digestion enzymatique sur membrane (Trypsinolyse la nuit à 37°C avec 100 microlitres de solution contenant 20 microgramme de trypsine/1,5 ml de tampon, voir détails dans la référence indiquée).   Dans un tel rapport les auteurs décrivent l’application réussie de la digestion enzymatique sur membrane de la Dystrophine native des protéines associées comme l’ Alpha-Sarcoglycane, le Gamma-Sarcoglycane et la Alpha-Syntrophine ainsi que l’identification biochimique de ces produits par spectrométrie de masse.

Ainsi avec la même méthode protéomique est-il possible d’obtenir une bonne estimation des fonctions biologiques qui présentent une expression altérée dans le cas d’un cœur déficient en Dystrophine. Un tel bilan permettrait alors d’avoir une interprétation facilitée des effets positifs et négatifs d’un traitement à condition de pouvoir disposer d’une analyse personnalisée pour chaque patient sous traitement.

Début 2011, une  nouvelle fonction serait dévolue à la Dystrophine , celle de recruter des phospholipides spécifique au sein de la membrane musculaire ceci pour permettre une organisation du cytosquelette un contrôle actif dans l’activité fonctionnelle normale des canaux dits mécano sensibles (MS), que l’on regroupe sous  2 types de familles de protéines, (les MscL CHANNEL FAMILY et les MscS CHANNEL FAMILY) On peut également consulter sur le chapitre de la mécanotransduction une revue qui fait le point sur le mécanisme par lequel la cellule effectue la  conversion des stimuli mécaniques en réponses biochimiques . Une nouvelle découverte indiquait qu’il existait également des stratégies qui se révèlent sans résultat encourageant. Ainsi la présente étude  démontre que l’expression transgénique de la chaîne α1 de la Laminine chez les souris déficientes en Dystrophine, entraînait la formation d’un hétéro trimère dit Laminine-111 dans les muscles de l’animal, mais n’améliorait pas le phénotype dystrophique. Des études complémentaires seront cependant à envisager pour confirmer ce résultat chez l’homme.

Des découvertes offrent aussi de nouvelles Perspectives de Thérapie, ainsi mieux connaitre le/les rôle(s) de la Dystrophine fait partie intégrante de la recherche de ces nouveaux axes. Ainsi une récente publication démontre l’importance de la Dystrophine pour une fonction normale du canal [K (ATP)] responsable du système cardio-protecteur dans les cardiomyocytes. Axer la thérapie sur une meilleure stabilité de ce canal est une nouvelle option. Globalement, les études menées en 2012 démontrent que, outre sa fonction durant la Synaptogénèse, ce  qui favorise l’intégration des constructions autour des récepteurs à l’acétylcholine (ACh) au sein des muscles, l’ Agrine neurale semble être capable de  promouvoir directement la fonction contractile du muscle via des mécanismes distincts de ceux impliquant directement ces derniers. Ainsi  une piste pour améliorer un muscle déficient en Dystrophine serait  de lui injecter une protéine recombinante correspondant à la séquence de la Mini-Agrine comme cela est rapporté dans l’article en référence. Un tel effet bénéfique ouvre la voie  à une nouvelle  tentative d’application chez l’homme.

Par ailleurs, le facteur homéo-domaine Barx2 est un nouveau marqueur des myoblastes embryonnaires et adultes est maintenant connu comme exprimé dans les cellules satellites et ce dernier est requis pour la croissance normale et régénération musculaire. Stimuler ce facteur pourrait être une piste de thérapie. Des  travaux démontrent que la déficience  en Dystrophine provoque la stimulation de la paroi des vaisseaux sanguins au niveau de la néo-intima. Ces résultats suggèrent que l’expression de la Dystrophine dans les cellules musculaires lisses vasculaires à la capacité de protéger contre l’épaississement de la paroi de l’artère dans les cas de  blessures induites du système vasculaire. Un travail de recherche rapporte le cas particulier des muscles du tour de l’œil (Muscles Orofaciaux) qui présentent  une distribution perturbée plus particulièrement de la Taline et de la Vinculine en absence de Dystrophine. D’autre part, les connaissances dans ce domaine de Dystrophie musculaire s’affinent, et l’absence de Dystrophine provoque une indirecte modulation de l’expression des gènes en rapport avec des aspects cruciaux comme le développement postnatal, la différenciation et la plasticité des neurones. (Voir détails dans un tableau identifiant les gènes surexprimés et ceux qui sont sous exprimés).

En 2012, une nouvelle découverte importante donne naissance à l’identification d’une nouvelle protéine associée au complexe multi-protéine associé à la Dystrophine, c’est la Myociline.- Elle était connue depuis 1997 mais associée à des problèmes en rapport avec la cécité. (Voir fiche correspondante). Les  données contenues dans l’article en référence suggèrent que les fuites des canaux Ryr1 peuvent se trouver impliquer dans  de multiples formes de dystrophies musculaires  en rapport avec  des mutations dans les gènes codant pour des composants du complexe macromoléculaire concernant  la dystrophin et les glycoprotéines associées. Ce constat décrit, en détails dans la référence indiquée, suggère que des produits pharmacologiques ciblant les RyR1pourraient être une nouvelle approche thérapeutique pour améliorer la fonction musculaire dans les membres des pathologies comme la dystrophie musculaire des ceintures et/ou de Duchenne. Les analyses sur les flux calcique Activité comparative de la NFkappaB dans un myotubeau niveau du muscle déficient en Dystrophine semblent indiquer que l’entrée  du Calcium  après des contractions excentriques aurait lieu au travers d’un canal dit sensible à l’étirage-actif qui serait bloqué par la streptomycine.  (Corrélation avec le type de canal TRPC1). Un récent travail démontre l’existence  d’une augmentation de l’expression de  l’IL-17(Interleukine-17)  chez l’homme atteint de Dystrophie musculaire de Duchenne, corrélée avec  des taux d’expression croissant d’autres cytokines pro-inflammatoires et l’évolution clinique de la pathologie DMD. Ce constat suggère un rôle pathogène possible de l’IL-17 Des résultats démontrent que l’augmentation du calcium intracellulaire dans un muscle au repos module l’expression dépendante  de iNOS via la protéine NF-kB. Ce résultat est obtenu en étudiant plus particulièrement  les myotubes squelettiques d’une souris dystrophiques de type mdx.

On savait que l’évolution de la pathologie DMD signifiait une augmentation de la fibrose dans les muscles, un rapport scientifique  constate chez les souris mdx âgées une plus grande abondance des protéines telles la Desmopontine et le Collagène en particulier dans son diaphragme. Un autre travail (Fin juin 2012), démontre que chez la souris déficiente en Dystrophine il existe une autre déficience qui concerne plus précisément une absence de migration des Lymphocytes T vers le muscle. De telles données fournissent de nouveaux aperçus sur les mécanismes d’infiltration inflammatoire et immunitaire et sa réglementation chez le patient DMD. Une dysrégulation des Métalloprotéinases  est observée chez les souris doubles mutantes pour la Dystrophine et l’ Utrophine, (Juillet 2012). Un article démontre pour la première fois que  l’effondrement des fibres musculaires attaquées par les lymphocytes T se fait par une nécrose probablement en raison de dommages du sarcolemme, en particulier avec activation de la Caspase-3. Un autre rapport récent indique une dysfonction des microtubules pour une cellule musculaire déficiente  en Dystrophine. Une analyse élaborée du Transcriptome  au niveau du muscle DMD (voir illustration de la Fig  4) indique une forte évidence de compatibilité avec cette observation. Il existe aujourd’hui une  altération démontrée pour la Phosphorylation de la MAP kinase  ( = Mitogène Activated Protein) chez la souris déficiente en Dystrophine, Une nouvelle analyse protéomique des protéines du muscle cardiaque indique que de nouvelles protéines associées à la Dystrophine viennent d’être découvertes. (voir tableaux N°1 et N°2 de l’article indiqué).

Par ailleurs en 2012: De nouvelles données révèlent l‘importance de la Dp71 pour la constitution d’un complexe DAPC fonctionnelle dans l’hypothalamus. Les conséquences d’une telle désorganisation DAPC sont analysées dans l’article en référence. Mais aussi en 2012 : Une forme particulière de la Dystrophie de Becker est maintenant décrite (Septembre 2012) suite à l’identification d’une mutation non-sens dans l’exon N°2  du gène codant pour la Dystrophine. Ensuite, chez la souris déficiente en Dystrophine, de nouveaux travaux indiquent que l’ouverture partielle et la durée de la salve prolongée de calcium sont des mécanismes distincts qui contribuent à l’entrée en excès du Ca2 + ce qui implique un rôle pour les canaux dits MS (=MechanoSensible). Par ailleurs, une explication serait que l’on doit tenir compte du fait que la variabilité de conductance de ces canaux MS peut être en relation avec la différence dans les sous-unités  qui composent ces canaux sous forme hétérodimèrique. Par ailleurs, un  travail original indique un mécanisme de remodelage spécifique dans le vieillissement muscle dystrophique qui s’avère détectable en utilisant une nouvelle technologie appliquée à la microscopie  dont le sigle anglais est Microscopie SHG (Second Harmonic Generation). .La technique permet d’obtenir des données de la morphologie du muscle malade en 3 dimensions,(voir détail dans l’article indiqué). La dysfonction mitochondriale dans un cas d’absence de Dystrophine peut être étudiée via l’analyse des mélanocytes. Cette nouvelle approche est abordée en détails. De nouvelles données,  sur l’évolution de la pathologie DMD avec l’âge,  montrent  que le Protéome de la souris déficiente en Dystrophine change. En particulier cela semble évident chez la souris en ce qui concerne les protéines exprimées dans le muscle Tibialis anterior. Si l’on compare un tel muscle chez la souris mdx âgés de 8 semaines versus 22 mois par spectrométrie de masse,  sur la base de la  protéomique il est évident que le niveau d’expression est altéré pour 8 protéines distinctes. Des taux élevés ont été enregistrés pour l’Anhydrase carbonique, l’ Aldolase, et la Flavoprotéine (protéine chargée du  transfert d’électrons), tandis que les taux d’expressions de la Pyruvate Kinase, de la Myosine, de la Tropomyosine, et  des Hsp27s (petites protéines de choc thermique),  ont été trouvées comme plus  réduits dans le muscle âgé. Une nouvelle analyse détaillée (Oct.2012) fait la revue  et confirme la contribution du stress oxydatif comme paramètre important dans l’évolution de la Pathologie DMD. Enfin décembre 2012, une étude donne actuellement une relativement bonne évaluation des paramètres de fatigabilité des muscles déficients en Dystrophine. Cette étude permet de mieux déterminer quels types d’exercices musculaires il est possible de proposer à ces patients en tant aide à une meilleure qualité de vie. Une meilleure évaluation de la capacité métabolique des muscles déficients en Dystrophine est aujourd’hui disponible. Ceci implique qu’une meilleure régulation du métabolisme lipidique de ces patients est fortement susceptible de leurs permettre de garder plus longtemps des muscles fonctionnels. Puis, une étude évalue un ensemble des marqueurs de l’inflammation dans un muscle déficient en Dystrophine au cours d’un exercice dit de contraction excentrique. Il s’agit chez l’homme  principalement  des entités suivantes : CD11b, CD16, CD66b, CD68, et plus…. L’héritage génomique des souris de la lignée dite “ superhealing MRL » semble améliorer ces  souris en regard de l’évolution d’une  dystrophie musculaire.

En 2013, une récente méthode consiste à pouvoir mieux suivre la synthèse des protéines en utilisant la méthode SILAC, c.à.d. une technique de marquage du métabolisme en utilisant des acides aminés contenant un isotope stable [13C6-lysine (SILAC mouse). Le profil protéomique des tissus musculaires d’une souris SILAC donne un nouveau bilan pour la synthèse en l’absence de Dystrophine (voir article indiqué). Les voies de signalisations pour un effet positif du Resveratrol  (un des polyphénols du raisin) sur le cœur des souris déficientes en Dystrophine sont clairement décryptées  dans l’article en référence (modulation de la protéine  p300). Aborder l’évolution histologique d’un muscle est maintenant Analyse comparative d'un muscle sain et patholoogiqueune technique fiable et relativement facile à interpréter via une méthode standardisée et automatisée de plusieurs paramètres histopathologiques qui est  applicable chez la souris. Utilisation  d’un coefficient de variance  (VC) dont la formule est donnée dans l’article et utilise le diamètre de Feret  pour définir la taille des cellules. Utilisation du logiciel accessible sur le WEB pour avoir un système d’analyses d’images standard (=S.CORE). Cela semble présenter l’avantage que chaque laboratoire utilisant une méthode identique pourra mieux établir ses propres résultats et les comparer avec ceux des autres laboratoires. Une illustration démontre par comparaison entre un muscle de souris sauvage et celui d’une souris mdx de 6 mois la forte proportion de fibres avec un noyau central comme cela est présenté ci-contre (plus de détails dans l’article en référence). Il y a dans ce travail une évidence pour une perte du marquage de la Dystrophine dans les cardiomyocytes, ceci avec une nouvelle technique de marquage pour un dépistage précoce. Chez la souris mdx au niveau de ses cardiomyocytes issus du ventricule cardiaque une nouvelle étude tends à impliquer la canal calcique de type L dans les altérations des flux de calcium mitochondriaux.

Une nouvelle étude révèle que la déficience de Dystrophine dans un muscle va s’accompagner de la perturbation des protéines de sécrétion associées aux vésicules liées à la protéines LAMP1. (=Lysosomal-Associated Membrane Protein de type 1). Il y a accumulation anormale dans le cytosol des cellules musculaires pour des vésicules contenant associée LAMP1/MLC1-3 (= Myosin Light Chain 1- Myosin Light Chain 3), c.à.d. les chaînes légères alcaline de Myosine de type 1 et 3 (voir fiche sur la Myosine). Modifications ultra structurales et fonctionnelles des éléments associés distribution relative de la Dystrophine et de l'Obscurineau couplage énergie-contraction dans les cardiomyocytes de la souris mdx: une analyse de surface de la membrane à la profondeur dans le cœur déficient en Dystrophine. (Février 2013). Autour du complexe réalisé à la membrane par l’ensemble des protéines associées à la Dystrophine (DGC =complexe entre Dystrophine et glycoprotéines), C’est en fait l’ Obscurine (voir fiche sur le site) qui semble également jouer un rôle important en tant que partenaire nécessaire à l’intégrité du Sarcolemme.  Tout indique que la relation Obscurine et DGC,   en référence à l’article indiqué, doit être à considérer pour le cas du muscle squelettique mais également dans le cas du cœur et même du cerveau. Le schéma ci-contre illustre la localisation de l’ Obscurine par rapport au complexe macromoléculaire autour de la Dystrophine.

Dans le cervelet il apparait suite à  une étude détaillée que la Dystrophine serait inégalement distribuée. De tels résultats soutiennent l’idée que la perte de la Dystrophine, en particulier dans le cervelet latéral est en partie responsable des déficits cognitifs dans la DMD et pour le modèle animal déficient en Dystrophine, la souris mdx.  Une nouvelle information : Un article propose une évaluation Phénotypique quantitative des chiens atteints de la dystrophie musculaire de Duchenne selon une  analyse de la démarche globale et du suivi de l’activité du jour au lendemain. La myogénèse est rapportée comme stimulée  si la phosphatase de type 5 qui inactive spécifiquement la kinase dite « mitogen-activated protein kinase » (=MAPK) soit la MKP5, également répertoriée chez l’homme comme DUSP10 (=Dual specificity protein phosphatase 10), est elle-même rendue déficiente au niveau d’un muscle Dystrophique. Cela peut être une piste de thérapie à envisager ? Importance de la stabilité membranaire en relation avec l’arrangement macromoléculaire autour de la Dystrophine et des filaments intermédiaires dans le cas des plaquettes. Une corrélation est maintenant bien établie entre la Défensine-bêta3  et la dégénérescence musculaire en particulier dans le cas de Myopathies dites « idiopathic inflammatory myopathies. ».

cibles des cellules candidates à une régénération musculairesLes études, présentées dans l’article en référence,  identifient la Cycline D2 (=CCND2),  comme un nouveau régulateur clé de la différenciation terminale des cellules progénitrices à destinées musculaires. Cette découverte ouvre de nouvelles possibilités pour le traitement de plusieurs formes de troubles musculaires caractérisés par une altération de la régénération et une perte de masse musculaire.

 Le processus de l’Ossification  Hétérotopique (HO = Heterotopic Ossification) et de l’Infiltration Graisseuse (FI= Fatty Infiltration) se produisent souvent dans le muscle squelettique  des atteints  de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ce travail démontre que la protéine dite RhoA est un médiateur qui induit une fonction défectueuse de cellules souches et du processus d’ossification dans les muscles déficient en Dystrophine (étude réalisée chez la souris). Analyses protéomiques des protéines altérées  dans un cœur déficient en Dystrophine. Ce rapport présente en particulier une diminution drastique pour les protéines suivantes : la Laminine, le  Nidogène et les Annexines

Toujours en 2013, une nouvelle approche  est présentée dans l’article en référence Cette analyse explique comment lier  la cytoarchitecture et le métabolisme cellulaire. Analyse qui concerne plus particulièrement  le cas  de la Plectine associée au sarcolemme et comment cette dernier affecte l’absorption du glucose dans myofibres MDX  Analyse des réseaux de microtubules et des facteurs déstabilisateurs de cette structure. Dans cet article il est indiqué que  l’expression du récepteur nucléaire liée aux récepteurs d’œstrogènes γ (ERRγ)  est  susceptible de réguler à la baisse (50-85%) dans les muscles squelettiques de souris mdx (modèle DMD),  les  objectifs métaboliques et angiogéniques cibles. Dans le détail, au niveau des fibres musculaires dites  oxydatives, la vascularisation du muscle et  la tolérance à l’effort (33%) sont diminués chez les souris mdx vs les souris de type sauvages. En sur exprimant le récepteur  ERRγ sélectivement dans les muscles dystrophiques, il y a chez les souris mdx une restauration de  l’expression des gènes liés au  métabolisme et à la régulation angiogéniques. Existence d’un Profil comparatif  publié en 2013 pour le Triacylglycérol et les types d’acides gras dans les phospholipides  du muscle cardiaque qui sont présents  chez la souris mdx versus les souris  contrôles C57BL/10ScSnJ Modulation sélective au travers du récepteur des glucocorticoïdes pour améliorer l’évolution de la pathologie musculaire chez la souris déficiente en Dystrophine. En Septembre 2013, un Bilan des Réponses des lymphocytes T,  vis-à-vis de l’anticorps  anti-Dystrophine dans la Myopathie de Duchenne: prévalence et l’effet du traitement avec des glucocorticoïdes. Les  données présentées, confirment la présence d’une immunité préexistante et circulante pour les lymphocytes T vis-à-vis de la Dystrophine, dans une proportion non négligeable, suite à des méthodes de thérapie qui implique l’utilisation du gène humain codant pour la Dystrophine. Dans le cas d’un traitement avec des  glucocorticoïdes chez des patients atteints de DMD, il est important  d’en tenir compte dans la conception et l’interprétation des Rôle des mmacrophages dans le muscleessais de thérapie génique avec des applications cliniques chez l’homme. (voir détails dans l’article en référence). Un autre travail indique que la Stabilisation du complexe Dystroglycane dans les bandes de Cajal durant la phase de  myélinisation des cellules de Schwann, il existe une étape ou se révèle un  ancrage de la Plectine médiée par des filaments de Vimentine. Le constat suivant indique qu’à la suite d’une ischémie des membres postérieurs, il est possible d’observer un effet néfaste des inhibiteurs de la classe spécifique des Histones déacétylase  durant la régénération tissulaire. Un schéma simple illustre le constat sur l’équilibre dégénérescence régénération.

Publié en Octobre 2013 un travail rapporte qu’un sédatif  correspondant à un produit chimique du type alkyle ester de nitrate d’alcool (voir détail dans l’article en référence) améliore la fonction et  la structure musculaire chez  le modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne (souris mdx). Un aspect tout à fait particulier chez la souris déficiente en Dystrophine à l’âge de 21 jours/ Cas spécifique d’une analyse mécanistique et morphologique du tendon calcanéen. Au niveau de la Dystrophine on observe un déséquilibre chez la souris mdx entre 5’ et 3’ dans la transcription du gène DMD. (Détails dans l’article indiqué et relation avec l’instabilité de certain transcrits courts chez les Becker). Le cytosquelette des plaquettes : mise en jeu du complexe protéique autour de la Dystrophine, une revue de 2013. Implication de la Nestine dans le rôle des cellules souches au niveau d’un muscle déficient en Dystrophine durant la phase tardive de l’évolution de la maladie. Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter la DMD (voir article indiqué). Comparative altération des glycoprotéines associées à la Dystrophine pour un cœur déficient soit en Dystrophine soit en Dystrophine et Utrophine. Analyse du muscle crânien dit « Couturier » chez le modèle canin déficient en Dystrophine  (=GRMD), Voies de signalisations conduisant à une hypertrophie classique et/ou nouvelle (voir détails dans l’article indiqué). Une étude des conséquences de la réduction de la voie de signalisation impliquant IGF permet au moins chez le modèle animal C. Elegans d’obtenir la survie des cellules musculaires. Une piste de thérapie qui semble prometteuse…

distribution de NOS et du type de Dystrophine dans un muscle cardiaqueEn 2014, une étude démontre qu’il existe bien des rôles distincts des TRAF6 à des stades précoces et tardifs dans le développement de la pathologie musculaire chez le modèle murin (souris mdx) de la dystrophie musculaire de Duchenne. Différences régionales et génotypiques dans les propriétés électrophysiologiques intrinsèques des cellules de Purkinje du cervelet comparativement chez  la souris mdx de type sauvage et la souris déficiente en Dystrophine. Dans cette étude, les résultats suggèrent que les fonctions de signalisation de la  Dystrophine sont en mesure d’améliorer la cardiomyopathie dilatée, et donc pourraient aider à améliorer la fonction du muscle cardiaque. En particulier  les approches de thérapie génique impliquant l’utilisation de micro-Dystrophines indiquent  des avancées positives dans ce domaine (voir illustration de la figure n°4 partie E de l’article en référence). Une reprise de cette illustration figure ci-contre et résume la situation ;

Présence décroissante au niveau du cerveau de la Prosaposine (- Prosaposine (PS), protéine qui est un facteur neurotrophique relativement abondant au niveau du plexus choroïdien ainsi que dans diverses régions du cerveau).chez la souris déficiente en Dystrophine . Déficit cognitif associé avec la  perte du transcript court de Dystrophine , dit Dp140. Des biomarqueurs sériques les Dystromires (= miR1, miR133a, miR133b, miR206, miR31), des outils pour réaliser  le suivi sur la gravité de la maladie dans la dystrophie musculaire de Duchenne . Analyse à considérer pour d’autres myopathies. L’intestin de la souris dystrophique présente une bonne résistance contractile à l’étirement  malgré déficience morphologique. Analyses précises du taux de Dystrophine chez les patients Becker plus ou moins sévèrement atteints. Il semblerait selon l’article en référence que la correction précoce du processus d’activation de la dérégulation autonome de la protéine RAS pourrait  fournir une nouvelle approche thérapeutique dans la dystrophie musculaire. Une augmentation des Courants Calciques par des canaux  de type L dans les cardiomyocytes perturbent l’électrophysiologie d’un cœur dystrophique. (Voir détails dans l’article indiqué). Utilisation d’une large batterie d’anticorps monoclonaux dirigés contre  la Dystrophine. Sur les 79 exons de la Dystrophine, des anticorps monoclonaux sont contre les exons simples 1, 6, 8, 12, 13, 14, 17, 21, 26, 28, 38, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 58, 59, 62, 63, 75 et 77, maintenant disponibles. Beaucoup ont été utilisés dans des essais cliniques, ainsi que pour le diagnostic et des études sur les isoformes de la Dystrophine. (Voir détails dans l’article en référence). schéma simplifié de l'altération du myocarde suite à une IRDécouplage par la stabilisation programmée du  sarcolemme, de l’augmentation du stress oxydatif cellulaire et des lésions myocardiques de type ischémiques suite à une  reperfusion. Le schéma ci-contre indique le processus par lequel le flux de calcium altère le myocarde et provoque le dysfonctionnement de la mitochondrie et conduit à la nécrose / apoptose musculaire. Bloquer l’entrée du calcium via   un copolymère stabilisateur du sarcolemme (copolymer-based sarcolemmal stabilizers = CSS), comme le Poloxamer 188 (P188) et conduira à un arrêt du processus en bloquant l’entrée du calcium et permettra de garder des mitochondries fonctionnelles.

Rôle des récepteurs  similaires au type « Toll »  dans la pathogenèse des muscles squelettique s et cardiaque déficientes en Dystrophine. Découplage par la stabilisation programmée du  sarcolemme, de l’augmentation du stress oxydatif cellulaire et des lésions myocardiques de type ischémiques suite à une  reperfusion. Rôle des récepteurs  similaires au type « Toll »  dans la pathogenèse des muscles squelettique s et cardiaque déficientes en Dystrophine. Analyse récente sur l’altération de la voie de signalisation dite « Notch » au niveau d’un muscle déficient en Dystrophine chez la souris et chez l’homme. (Voir les détails des tableaux de mesures morphologiques des muscles). La Perte de la Dystrophine et du β-Sarcoglycane, respectivement, aggrave considérablement le phénotype des Animaux dont  la chaîne Alpha2 de la Laminine  est déficiente. Les réponses hyperactives indésirables au stress mécanique dans un cœur déficient en Dystrophine, sont couplées au canal  TRPC6 et bloquées par la modulation de la voire de signalisation cGMP-PKG. Chez le modèle  animal de la dystrophie musculaire de Duchenne, le  poisson zèbre,  .un récent travail indique que l’histone déacétylase (HDAC) TSA, améliore bien le processus évolutif de la pathologie Même une faible quantité de Dystrophine exprimée dans le Cœur peut retarder l’insuffisance cardiaque chez la souris mdx. L’absence de Dystrophine  augmente la dépense énergétique et le renouvellement des protéines dans le modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne. chez la souris mdx. Favoriser  l’Angiogenèse,  comme une nouvelle stratégie thérapeutique pour la dystrophie musculaire,  est une bonne stratégie pour provoque rune diminution  de l’ischémie et une augmentation des cellules satellites (cellules souches musculaires). Il semblerait qu’il y a une plus grande efficacité  si on utilise des  liposomes  cationiques pour un ciblage de la  livraison locale de petits ARN interférents avec  la Myostatine, in vivo. Dysfonction du métabolisme pour le  glycogène musculaire et hépatique chez la souris déficient en Dystrophine. Dans ce récent travail la présence, l’activité et la localisation de l’enzyme dont le sigle est ACE2 (enzyme qui est responsable de la production de l’Angiotensine II  et dont le peptide dit « Ang (1-7) » possède un effet opposé à l’Angiotensine II, sont démontrés comme augmentés et joue un rôle dans la diminution de la fibrose musculaire.

potentielle relation entre tumeurs cancéreuses et gène de la DystrophineToujours en 2014, chez les souris mdx, il est rapporté une modification significative du processus de libération d’acétylcholine dans l’hippocampe. La Dystrophine et l’Utrophine se distinguent dans le type d’accrochage aux microtubules. Un récent travail constate que la fibrose et l’inflammation est plus importante chez un animal déficient en Bêta Sarcoglycane qu’en Dystrophine. Relation entre le développement postnatal et la polarisation des astrocytes et le complexe des protéines associées à la Dystrophine  Étude sur l’expression différentielle des gènes impliqués dans l’homéostasie du calcium au niveau des  muscles de la mastication de la souris mdx. La Dystrophine est un gène capable de jouer le rôle de suppresseur de tumeur dans les cancers humains avec des programmes myogéniques. Un tableau récapitulatif indique au niveau des 79 exons codant pour la Dystrophine les types de tumeurs cancéreuses concernées (voir détails dans l’article en référence) La protéine kinase dite MAPK de type 38 Alpha entraîne la mort des fibres musculaires grâce à un mécanisme Bax-dépendant, dans le cadre d’une dystrophie musculaire. Mieux comprendre le principe de la fibrose chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne (Voir le schéma didactique avec Le système Rénine –Angiotensine dans la fibrose). Une approche pour préserver la fonction musculaire chez la souris mdx (Déficiente en Dystrophine) serait d’inhiber l’expression de la Caspase de type 12.  Analyse Protéomique et pertinence  pour le muscle normal et/ou  déficient en Dystrophine de la distribution et du rôle des Protéines de choc thermique (Heat Shock Proteins). Le motif dit « PDZ-Domain-Binding » contrôle et régule les compartiments de Progression de la pathologie DMD avec l'agedistribution spécifique du canal « NaV1.5 » au sein des  cardiomyocytes. Une déficience dans la voie de signalisation impliquant Notch est à la base de la dépendance selon l’âge d’une diminution en cellules satellites dans une  dystrophie musculaire. Les niveaux d’expression des protéines de réparation sarcolemmiques (= de la membrane en relation avec la Dysferline) en relation avec  le résultat d’un exercice prolongé chez les souris. Des nouvelles sur la  Dystrophinopathie. Le schéma ci-contre propose un bilan protéomique sur l’évolution de la pathologie DMD en fonction de de l’âge chez la souris mdx.

Étude selon  la structure des muscles de l’expression de l’ Utrophine. Connexion entre Dystrophine et/ou Utrophine et Aciculine : Une interaction entre les protéines Filamine C et Xin avec l’ Aciculine  se révèle comme  essentielle pour un bon assemblage de la maintenance et de la régénération de la myofibrille. (Voir les schémas en fin d’article en référence et le chapitre sur l’ Aciculine) Un nouveau concept, la Dystrophine comme agent suppresseur des cancers de type myogéniques. Des données qui mettent en évidence des mécanismes sous-jacents de la pathogenèse de la DMD et oriente son traitement vers  la NADPH oxydase et la Src kinase comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Identification de biomarqueurs diminués et/ou augmentés qui sont susceptible d’être une indication d’une déficience en Dystrophine. (voir détails dans l’article en référence). La protéine dont le sigle est «  SIRT1 » est un capteur métabolique et régulateur dans divers tissus et fonctions de mammifères pour contrer les maladies métaboliques et liées à l’âge. Dans l travail ici en référence, cette protéine favorise le passage d’un muscle lent vers un muscle rapide et améliore l’évolution de la pathophysiologie d’un muscle déficient en Dystrophine chez la souris modèle de cette pathologie. Une altération de la régulation de la Dystrophine  est associée à la progression tumorale des tumeurs stromales gastro-intestinales chez les mutants  KIT / PDGFRA (voir détails dans l’article en référence). Identification du site stratégique pour favoriser l’assemblage et la glycosylation des glycoprotéines associées à la Dystrophine et formant avec elle un complexe.  Améliorer la fonction de l’appareil locomoteur chez le modèle de la souris déficiente en Dystrophine. La voie de Signalisation « SMAD » en  excès contribue à un dysfonctionnement du cœur et du muscle dans la dystrophie musculaire. Analyse de l’homéostasie musculaire dans la myopathie de Duchenne: La modulation autophagie comme une Marquage fluorescent 1 seule molécule détectablestratégie thérapeutique prometteuse. La phosphorylation de la région riche en cystéine de la Dystrophine permet d’améliorer son association avec le Bêta-Dystroglycane. Cela offre une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour traiter l’atrophie du muscle squelettique déficient en Dystrophine. La  Dystrophine voit sa  liaison au complexe avec les glycoprotéines  renforcée par la présence de la Dystrobrévine  et cela  fournit une protection lors d’un stress cardiaque. Le canal intracellulaire pour le calcium dit  « MCOLN1 »     est nécessaire pour que le processus de réparation membranaire fonctionne normalement et prévenir contre un potentiel développement de Dystrophie musculaire. Mieux suivre les flux de calcium dans un muscle déficient en Dystrophine (Une seule  molécule, voir détails dans l’article en référence). Une seule molécule est ainsi ciblée comme le montre l’illustration provenant de ce travail.

Une tentative d’explication sur le rôle des protéases au cours des cycles d’excitation-contraction du muscle et la perte du couplage chimique en cas de dystrophie musculaire. Un dimère de l’ Apocynine (inhibiteur de la NADPH Oxidase) baptise « Diapocynine » permet de réduire la production des ROS et protège le muscle (Voir détail dans l’article en référence). Analyses détaillées des altérations biochimiques et morphologiques des tendons d’ Achille chez la souris déficiente en Dystrophine. Selon l’âge fluctuation des concentrations en calcium et sodium au cours d’une cardiomyopathie (Voir détails dans l’article en référence).   Une méthode originale pour obtenir l’assemblage moléculaire autour de la Dystrophine  est décrite dans l’article en référence    De nouvelles approches non invasives pour appréhender l’évolution lente des changements dans l’image et la production d’énergie dans un muscle déficient  en Dystrophine chez la souris mdx. Des défauts dans la synthèse de l’ ATP dans les muscles squelettiques de la souris mdx déficiente en Dystrophine peuvent être provoqués par une insuffisance du complexe 1 mitochondrial.

En 2015, les Conséquences de la perte de la protéine nNOS : Inhibition de la compensation hypertrophique musculaire avec exacerbation de l’inflammation et de l’altération musculaire accrue suite à une contraction dite « excentrique » chez la souris mdx. Une autre approche avec de  nouveaux anticorps dirigés contre l’ Alpha-Dystroglycane permettent démontrent que la protéine n’est pas altérée de la même manière parmi les patients atteints de Dystroglycanopathie. Une Analyse quantitative automatique de l’organisation des T-tubules cardiaque en utilisant la méthode dite « ImageJ ». Un des rôles de la protéine ADAM8 dans l’élimination des fibres musculaires lésées avant régénération du muscle squelettique est abordé dans le travail indiqué.  La perte de la localisation de la protéine « AQP4 » avec perte de l’ immunoréactivité du β-Dystroglycane peut provoquer un œdème cérébral suite à  une hémorragie intracérébrale. La jonction neuromusculaire et la maintenance de fibre musculaire adulte nécessite le bon fonctionnement de la voie de signalisation ERK1/MAP kinases. La forme Gamma du Sarcoglycane est requise pour que la Nouvelle cascade de signalisation pour la mort cellulaire programméeprotéine baptisée Archiviline réalise dans le muscle squelettique une stimulation mécanique correcte Un nouveau mécanisme de mort cellulaire autophagique dans le muscle dystrophique est régulé par le récepteur P2RX7 responsable de la formation des pores de grand calibre  et la HSP90. (Voir schéma didactique dans l’article en référence). La reprise de ce schéma est à intégrer avec le complexe autour de la Dystrophine et les conséquences de son absence au sein de la membrane du muscle (voir article en référence).

Le complexe des Sarcoglycanes est exprimé dans le système vasculaire cérébral et est spécifiquement régulé  dans les cellules astrogliales  par les  canaux   CX30 (= Connexine-30). Les canaux calcique dits « (SOCE= StoreOperated Calcium Entry)  contribuent  à une altération de  signalisation par le calcium dans les myoblastes dystrophiques de la souris mdx. Localisation nucléaire de la protéine α-Dystrobrévine associée à la Dystrophine via la protéine Importine α2 / β1. Rôle important et  essentiel pour  une bonne interaction avec la lame basale et le  maintien de l’intégrité nucléaire. Le rôle de la signalisation Notch dans pro génitrices des cellules musculaires épuisement et l’apparition rapide d’histopathologie dans la dystrophie musculaire.

Un rôle possible de la Dystrophine dans l’excitabilité neuronale une revue de la littérature actuelle. Une meilleure caractérisation du complexe Dystrophine/Glycoprotéines dans le muscle lisse bronchique : rôle du δ-Sarcoglycane dans la réactivité bronchique. Cas particulier dans l’épilepsie  durant la phase latente du lobe temporal, observation d’une augmentation de la signalisation calcique  dans les astrocytes, (détails dans la référence indiquée). Une vie normale sans la Dystrophine. Juste un commentaire pour la vie musculaire sans Dystrophine. Effet des glucocorticoïdes sur la stabilité de la membrane musculaire chez la souris. Une nouvelle étude rapporte la dysfonction métabolique et altération mitochondriale chez le double mutant déficient en Dystrophine et en Utrophine. Une nouvelle preuve sur l’existence d’une  perturbation du potentiel d’action et d’  une altération des propriétés de signalisation du calcium au niveau des  myofibres sans Dystrophine chez la souris modèle mdx. Une recherche tente chez la souris dans le travail publié  ci-contre de déterminer la quantité suffisante et nécessaire de Dystrophine pour que cela est des conséquences augmentation de l'activité des enzymes du cycle de KREBSpositive sur l’évolution de la pathologie DMD.

Une information importante, à savoir,  l’activité des enzymes du cycle de KREBS chez la souris mdx. Une illustration reprend ce résultat (tableau de l’article indiqué) dans lequel il apparait que l’absence de la Dystrophine se répercute sur l’activité des enzymes du cycle de KREBS étudiés. En particulier il y a augmentation de l’activité de la malate déshydrogénase dans le cortex, l’augmentation de l’activité de la malate déshydrogénase et de la succinate déshydrogénase dans le diaphragme, et l’augmentation des activités de la citrate synthase, de l’isocitrate déshydrogénase, et de la malate déshydrogénase activités dans les quadriceps des souris MDX

corrélation absence de dystrophine et concentration du calcium cellulaireUn autre travail de 2015 conforte l’opinion sur la pathologie DMD à savoir que chez la souris mdx cela représente  une myopathie sévère aggravée par hypotrophie, l’hypertrophie et l’hyperplasie. Une meilleure connaissance de l’atteinte cardiaque chez la souris modèle de la pathologie DMD est résumée dans un rapport récent (Mai 2015). Un schéma récapitulatif démontre que l’absence de Dystrophine si elle provoque l’écroulement du complexe des protéines associées va se traduire par une forte augmentation de la concentration du calcium interne ce qui provoque tout une cascade d’évènements allant de la dérégulation des mitochondries mais aussi de la délocalisation de nNOS et de nombreuses autres voies de signalisations qui vont être altérées (Voir détails dans l’article en référence).

Surexpression de la micro Insuline-like Growth Factor mIGF dans le muscle de la souris mdxCas chez la souris mdx  d’un micro ARN qui est en mesure de moduler L’entité IGF-1 (Insulin-like growth Factor-1) localement et de favoriser la modification de l’expression de certains des acteurs  actifs de l’homéostasie du muscle , même en l’absence d’expression de la Dystrophine, ce qui a comme conséquence d’ activer des voies de signalisation qui confèrent plus de  robustesse à son muscle dystrophique. Une illustration permet d’appréhender l’impact possible sur diverses voies de signalisation d’une augmentation significative de l’expression de la micro IGF-1.

Évaluation Pathoprotéomic simultanée des changements  secondaires concernant le complexe altéré  Dystrophine-Glycoprotéine chez la souris de la myopathie de Duchenne de type mdx4cv. Plusieurs schémas et tableaux récapitulent la méthode d’extraction permettant de visualiser les déficiences et les augmentations protéomiques chez cet animal modèle dont la pathologie semble plus proche de celle enregistrée chez l’homme que dans le cas de la souris modèle mdx. En majorité on va trouver des protéines constitutives du muscle mais également des enzymes et des protéines nucléaires (voir détails dans l’article en référence).  Une nouvelle étude permet de mettre en évidence un phénotype cardiospécifique de la Dystrophinopathie, analyse de la cardiomyopathie dilatée liée au chromosome X.

Ce nouveau travail indique les Implications pour la fonction cardiaque suite à un sauvetage de l’intégrité de la membrane chez la souris mdx. Une récente analyse de divers agents qui inhibent la signalisation NF-kB, indique les  conséquences sur le blocage spontané de l’activité  contractile mais cela va  influencer négativement la survie des myotubes en développement.

Dans des travaux plus anciens il avait été découvert qu’un clivage spécifique de la Dystrophine pouvait être provoqué par une protéase de type entérovirale  2A, suite à une infection par des entérovirus comme le coxsackievirus B3 (CVB3). Le clivage est proposé comme ayant lieu au sein de la zone flexible dite H3 au niveau 2434 pour la version humaine de la Dystrophine, (ce qui correspond au résidu  2427 pour la Dystrophine chez la souris). Un tel clivage est rapporté à l’époque comme altérant la bonne fonction de la Dystrophine en particulier dans le cœur qui perdrait en partie son association avec les Sarcoglycanes et les Dystroglycanes, cependant un traitement avec divers types de donneurs de NO avec des concentrations variables de Effets délétères du fragment CtermDys dans le coeurPAPA-NONOate, et/ou de  spermine-NONOate, permettait d’inhiber  le processus de clivage. Dans le présent travail l’analyse à consister à mieux évaluer les conséquences d’une Dystrophine tronquée n’ayant plus que la séquence correspondant à une extrémité N-terminale débutant par  la zone de flexibilité H3 jusqu’à l’extrémité C-terminale intacte. Un tel produit codifié « CtermDys » dans cette étude  se trouve susceptible de se localiser normalement à la membrane de la fibre musculaire et les conséquences sont décrites en détails en particulier le rôle potentiel d’un tel fragment de Dystrophine empêchant alors l’Utrophine de venir compenser ce défaut. Une stratégie de thérapie est ainsi proposée pour annuler les effets néfastes d’une telle Dystrophine tronquée qui provoque une sévère cardiomyopathie. Un schéma récapitulatif des résultats présentés dans l’article en référence propose une explication pour illustrer comme cela est indiqué  ci-contre le processus de la pathologie dans le cœur.

Rôles différents pour la MMP9 chez la souris MDX âgée par apport à la souris jeune. Le dysfonctionnement cognitif chez la souris déficiente en Dystrophine : Une réévaluation du processus exécutif sensoriel. Une réévaluation du processus exécutif sensoriel. Détections des anomalies dans la structure du cerveau de la souris déficiente en Dystrophine mesurées par IRM, (détails dans la procédure indiqués dans l’ articleprotection du muscle par l'adiponectine en référence) .

Nouvelle analyse détaillée des modifications structurales et fonctionnelles de la micro vascularisation du  muscle squelettique chez la souris mdx déficientes en Dystrophine. Dans cet autre travail il est  récapitulé comment s’effectue le développement de la lignée des cellules souches pluripotentes in vitro chez la  souris et chez l’homme pour produire des fibres musculaires multinucléées puis des myofibrilles organisées avec l’implication du facteur Pax7+ pour donner  des cellules présentant les caractéristiques des cellules satellites.

Une étude détaillée sur l’impact de la participation de l’Adiponectine et son entrée dans la cellule musculaire ainsi que les voies de signalisation jusqu’au noyau montrent comment, cette hormone qui intervient dans la régulation métabolique du glucose et des lipides, interfère  dans la pathogenèse de Dystrophinopathie. Un schéma récapitulatif permet de résumer dans une illustration simple les différentes étapes comme cela est présenté ci-contre.

La liaison Inter-domaine entre 2 motifs  tandem CH (Calponin-Homology Domain, dénommés CH1 et CH2)   détermine principalement la stabilité structurelle de la Dystrophine et de l’Utrophine plutôt que leur affinité à se lier à  l’actine. Dans le détail ce travail indique que la séquence  qui se trouve entre les domaines CD de l’Utrophine et/ou de la Dystrophine possède une propriété particulière et va se trouver baptisée de DUL  dans le cas de l’Utrophine et UDL dans le cas de la Dystrophine.  Ainsi une  Dystrophine ayant ses domaines CH avec une séquence connective  de type (DUL) aura une stabilité similaire à celle de l’Utrophine tandis qu’une Utrophine avec une séquence connective de type (UDL) aura une stabilité similaire à celle de la Dystrophine Il est connu que la Dystrophine se lie à la F-actine par ses motifs CH avec une affinité environ 30 fois plus faible que celle de l’Utrophine. Après permutation des liaisons servant à la connexion entre les domaines CH, une Dystrophine modifiée  DUL une affinité 2 fois supérieure à celle de  la Dystrophine native tandis que l’Utrophine combinée avec la portion de connexion UDL aura une affinité divisée par 2. Cependant des calculs dont le détail est donné dans l’article en référence  conduisent à des résultats qui  indiquent que la région de liaison UDL et/ou DUL détermine principalement la stabilité structurelle entre les domaines CH en tandem plutôt que leur affinité liant l’actine. Dans cet article on trouvera un schéma récapitulatif illustre la comparaison entre ces zones de connexions entre les domaines CH1 et CH2 au niveau de la Dystrophine et de l’Utrophine.

Mise à jour les plus récentes:

 

Une revue récente de 2015 met à jour les données sur la Dystrophine responsable de deux types de maladies génétiques proches mais différentes, les dystrophies musculaires de Duchenne et Becker. (consulter les illustrations et en particulier le cas des traitement pour les traitement par épissages particuliers permettant la délétions des exons 45-46 et/ou 44-45). D’autre part il a été détecté un nouveau type de Duplication du domaine dit central « en forme de bâtonnet » au niveau de la Dystrophine qui finalement va conduire à une cardiomyopathie dilatée liée au chromosome X.

Toujours en 2015, la Protéine nommée GRAF1 (Guanosine triphosphatase (GTPase) Regulator Associated  with  FAK-1) peut-être dynamiquement recrutée au niveau de la membrane plasmique endommagée des muscles squelettique et cardiaque et que les membranes appauvries en protéine GRAF1possèdent des capacités de guérison réduites. Dans le cas d’une déficience en Dystrophine les dommages musculaires chez les souris sont aggravés et un modèle murin double déficient Dystrophine / GRAF1présente une pathologie musculaire sévère comme  observée chez les souris déficientes en Dystrophine et en Dysferline.  Ainsi il est établi que la protéine GRAF1 associée avec la Dysferline est susceptible de mieux réguler la réparation de la membrane plasmique.

Le Naproxcinod  (voir formule) représente des avantages significatifs par rapport au Naproxène (voir formule)  pour les approches thérapeutiques sur le  modèle murin MDX de la myopathie de Duchenne. De nouvelles informations sont actuellement disponibles sur le processus de contrôle de la respiration chez la souris déficiente en Dystrophine. Cette étude démontre que dès l’âge de huit semaines on peut détecter un phénotype respiratoire spécifique chez la souris mdx.

Une stratégie qui concerne une inhibition sélective de la Connexine-43 prévient une arythmie induite par l’ isopréraline (ou Isoproterenol)  et élimine la létalité d’un tel produit chez une souris atteint de Dystrophie musculaire. Un micro ARN  correspondant au gène codant pour le TNF-α est capable d’induire  un contrôle de l’expression de la Dystrophine dans un muscle atteint de la dystrophie musculaire de Becker. Un travail récent propose d’utiliser une Isoflavone (la Génestine, voir définition et formule) pour moduler l’action de le nNOS afin de mieux contrôler l’apoptose musculaire chez la souris mdx. Une Carence en Dystrophine réduit le développement de la plaque d’un athérosclérose chez la souris qui n’exprime pas la protéine ApoE (=petite protéine de 317 résidus chez l’homme qui sert de liaison pour l’internalisation, et le catabolisme des particules de lipoprotéines). Ce travail est réalisé sur des souris double mutantes (ApoE/mdx).

Une analyse cinétique sur l’ultrastructure musculaire chez le modèle animal C. elegans choisi pour l’étude de la myopathie de Duchenne met en évidence un rôle crucial pour les structures d’ancrage des sarcomères et pour  l’intégrité du sarcolemme dans les premières étapes du processus de dégénérescence musculaire. Chez la souris  déficiente en Laminine Alpha-2 une absence d’ Intégrine Alpha7 n’aggrave pas l’état du muscle malade.Il est connu que la surexpression transgénique de la protéine  B4Galnt2  stimule la glycosylation de l’Alpha-Dystroglycane et permet une meilleure relation avec la laminine-2. Pour autant, envisager la suppression de Galgt2 (B4Galnt2) réduit bien la croissance musculaire en réponse à des traumatismes mais  augmente l’inflammation musculaire chez les souris déficientes en Dystrophine.

Ce nouveau travail démontre que l’activité biologique d’un ensemble peptide-(acide nucléique)  (PNA=Peptide Nucleic Acid) est efficace pour une restauration de l’expression de la Dystrophine chez la souris mdx déficientes en Dystrophine suite à une injection par  voie intramusculaire. Ce travail démontre les avantages,   le potentiel systémique et la faisabilité de l’utilisation de tels  PNAs  pour initier ainsi un saut d’exon.

Schématique Circulation du nitrate dans le MuscleDans le cas où le muscle squelettique est capable de se contracter normalement, l’oxyde nitrique (NO)  est libéré par la protéine nNOSμ  sarcolemmique ce qui atténue la vasoconstriction α-adrénergiques,  tout en optimisant ainsi la perfusion. Chez  souris mdx atteinte Dystrophinopathie, ce mécanisme de protection (sympatholyse fonctionnelle) est défectueux causant une ischémie musculaire fonctionnelle .Chez un patient Becker, un traitement proposé est avec un donneur d’NO- médicament anti-inflammatoire non-stéroïdien (NSAID = Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug) pour  atténuer cette ischémie et améliorer le phénotype dystrophique murin. Un schéma récapitulatif  illustrant la  circulation de NO2 qui est ainsi ramené via la désoxy-hémoglobine dans l’espace micro vasculaire, mais aussi  par la désoxy-myoglobine dans les myocytes squelettiques, ce qui conduit à des améliorations dans la régulation de la circulation sanguine du muscle squelettique.

Un bilan sur les progrès et les perspectives de thérapies géniques concernant les essais cliniques pour les dystrophies musculaires est actuellement disponible dans le rapport en référence. Cette étude contient en particulier un tableau récapitulatif actualisé sur les traitements des  pathologies   DMD / BMD   durant cette dernière année (jusqu’à Août 2015)

Une nouvelle voie d’approche pour restaurer l’expression de la Dystrophine et sa fonction chez la souris mdx est proposée dans ce travail permettant une suppression d’une grande région du gène DMD. La technique utilisée est la technique CRISPR (= Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) avec les ARN de type g (= guided).   Alors une  transfection de la construction Cas9 / ARNg  peut être réalisée par électroporation dans les muscles squelettiques mais aussi de manière plus efficace via la transduction avec un adénovirus d’une construction Cas9/ARNg. Cela est illustré dans ce travail pour le cas d’une mutation concernant l’exon 23 et un saut d’exon réalisé qui permet un passage direct de l’exon 20 vers l’exon 24 (voir détails dans l’article).

 

La méthodologie dite FRAP (=Fluorescence Recovery After Photobleaching) permet de suivre sans difficulté la dynamique d’un tissu musculaire déficient en Dystrophine in Vivo. Cette technique appliquée sur le modèle animal du poisson zèbre avec lequel on peut suivre l’expression d’une construction de Dystrophine humaine porteuse en C-terminal d’un marquage fluorescent  comme la GFP (green Fluorescent Protein), est ainsi décrite en détail dans l’article en référence.

Dystrophie Musculaire et implication de P2RX7Les approches thérapeutiques nouvelles se multiplient. En effet, parmi les récepteurs de l’ATP chez l’homme une attention particulière est portée sur le purinocepteur P2RX7. Ainsi  il semble bien que ce dernier soit augmenté dans le cas d’une Dystrophie musculaire et cela pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique et en induisant une inhibition de son expression  pour améliorer les symptômes d’altérations musculaires rencontrés chez les patients DMD.  De plus un autre travail sur la présence extracellulaire d’adénosine triphosphate (ATP) libéré par les cellules mourantes qui est ressentie comme un danger associé à un motif moléculaire via le récepteur purinergique  P2 récepteurs démontre lui aussi qu’un blocage de l’axe impliquant les ATP extracellulaire / P2X (entité P2RX7),  va favoriser l’amélioration des caractéristiques inflammatoires et être associé avec une résistance accrue et une nécrose réduite, suggérant ainsi qu’un tel antagonisme purinergique d’origine pharmacologique serait capable de modifier la composante immunitaire adaptative via une infiltration musculaire et pourrait représenter une approche thérapeutique prometteuse dans la myopathie de Duchenne.

transplantation de cellules myogéniques en présence de lamininePour stimuler la régénération musculaire un travail original suggère l’utilisation de la thérapie via une injection intramusculaire de Laminine 111 pur stimuler la prolifération des cellules satellites.  La présence de Laminine en tant que cofacteur durant une transplantation de cellules myogénique va améliorer la thérapie qui consiste à favoriser une réparation d’une lésion musculaire. Parmi les myoblastes transplantés certains vont suivre une voie apoptotique tandis que peu d’entre eux suivront une voie proliférative. La présence de forte quantité de Laminine va favoriser la voie de la prolifération en induisant ainsi une meilleure régénération musculaire. Un schéma récapitulatif illustre un tel processus au cours d’une observation cinétique des effets de la co-transplantation de cellules souches à potentiel myogénique et de Laminine 11 va très tôt stimuler la survie, la prolifération et la migration de ces cellules myogéniques. (voir détail dans l’article en référence) et schéma ci-contre.

Dans cette étude chez la souris il est apporté des évidences comme quoi la protéine SIRT1: serait potentiellement ne nouvelle cible pour le traitement des dystrophies musculaires. En effet  ces travaux  montrent  que l’activation de SIRT1 fournit des effets bénéfiques chez la souris mdx.  Une  activation de la protéine SIRT1 conduit à  une atténuation du stress oxydatif et de l’inflammation, avec  une suppression de la fibrose tissulaire. En consultant le dernier schéma didactique illustrant ce travail on a des informations sur les différentes étapes ou la protéine SIRT1 est susceptible d’intervenir dans le muscle et/ou au niveau des fibroblastes mais le mécanisme d’action reste encore à élucider.

Recherches Fondamentales Récentes:

 

Ce travail décrit que le complexe des Glycoprotéines associées à la Dystrophine ( DGC)  favorise l’activation mécanique de nNOS cardiaque en agissant comme un mécanorécepteurs qui est capable de réguler l’activité de l’AMPK, et que l’activation pharmacologique de l’AMPK pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique  plus appropriée que les voies actuellement envisagées pour restaurer l’activité nNOS dans les cœurs et dans les muscles déficientes en Dystrophine. En outre, si la sous-unité β1 de la Guanylate Cyclase soluble (CGT), est responsable de la production de cGMP via  la signalisation de l’oxyde nitrique (NO), ce récent travail indique qu’elle est  également détectée au niveau des Disques Intercalaires dans le Cœur (IDs.) Ainsi l’ensemble des  résultats présentés dans ce travail suggèrent un nouveau rôle de la nNOS au niveau des IDs par le biais de  la voie NO dépendante du GMPc et cela permet le maintien de la morphologie du disque intercalaire (ID).

Ce récent  travail présente une méthode pour développer des cellules satellites fraichement isolée à partir soit d’un tissu musculaire sain et/ou dystrophiques et un protocole pour obtenir une aide transitoire de l’expression du facteur  Pax3. Cette approche est alors proposée comme  combinée avec correction génétique du gène codant pour la Dystrophine en utilisant une construction correspondant à une mini-Dystrophine, et cela permet de démontrer que l’expansion induite du facteur Pax3 va favoriser  la correction génétique des cellules Dystrophique satellite comme cela est présenté en détails dans le travail en référence.

Les microARNs (miRs) sont un groupe de courts ARN non-codants endogènes. Un certain nombre de ces miRs sont principalement exprimé dans les muscles squelettiques et cardiaques (MIR-1, miR-21, miR-133, miR-208, etc.). Ces molécules jouent un rôle essentiel dans la régulation de la traduction et de l’expression génique post-transcriptionnelle. Ils sont capable de réguler finement la sortie d’ARN messagers cibles  (ARNm) en induisant leur déstabilisation et / ou l’inhibition de la traduction. Le but de cette étude était d’identifier les potentiels  miRs susceptibles de réguler l’expression de NOX2 dans la dystrophie cardiaque au stade préclinique de la maladie. Les résultats obtenus dans ce travail suggèrent que la régulation par miR-448-3p conduit à l’augmentation de l’expression des gènes codant pour   Ncf1 et la protéine p47, ainsi que  l’augmentation substantielle de la production de NOX2 et de ROS. Le stress oxydatif cellulaire qui en résulte, déclenche une suite d’événements qui aboutissent finalement à des dommages de tissu cardiaque et au développement de la cardiomyopathie. Ainsi ce travail indiqué en référence démontre un rôle central de miR-448 dans le développement de la cardiomyopathie induite par les ROS.

Les cellules de Sertoli (SEC), une composante majeure des tubes séminifères, sont connues depuis longtemps pour leur capacité à sécréter des facteurs  trophiques, anti-inflammatoire, et immuno modulateurs. Il est possible d’utiliser de telles cellules en les encapsulant en présence de sodium dans des microcapsules d’alginate hautement purifié. Ainsi il apparait actuellement, comme nouvelle perspective de thérapie pour restaurer la morphologie musculaire et la performance des muscles chez la souris dystrophique, que pratiquer une injection intrapéritonéale de cellules de Sertoli microencapsulées permet d’apporter  un net bénéfice au muscle malade . ce type de cellule figure sur le schéma récapitulatif de la thérapie cellulaire (chapitre Dystrophine : Les Pistes Thérapeutiques)

Dans ce travail original figure la première preuve qu’une mutation empêchant l’expression de la Dystrophine au niveau du cerveau va affecter le comportement social et la communication chez les individus DMD. CE paramètre apporte un nouvel éclairage sur les facteurs cognitifs, et émotionnels (et plus largement  le processus de venir à connaître et à comprendre; le processus d’encodage, le stockage, le traitement et la récupération d’informations) facteurs  qui contribuent au développement de traits autistiques chez le modèle murin de cette maladie.

Chez le poisson zèbre on observe in vivo une absence de la progression du développement de la dystrophie musculaire dans le cas particulier ou soit  la Dystrophine soit  la chaîne alpha2 de la Laminine sont absentes.  Ce but sera atteint par un traitement précoce qui va empêcher l’apparition des modifications de structures de la membrane musculaire  suite à une activité physique normale. Le protocole utilisé sur des larves de poisson Zèbre est de les  immobiliser in vivo en utilisant du N-benzyl-sulfonamide ptoluene (BTS) C.à.d. une petite molécule inhibitrice de l’activité ATPasique de la Myosine stimulée par l’Actine]. Chez ces larves de poisson zèbre, il est alors possible de garder les muscles détendus et immobiles de larves durant 18 heures et jusqu’à  4 jours après la fécondation avec ce traitement  BTS. On observe  ensuite une performance contractile plus faible mais pas de progression de la Dystrophie musculaire qui accompagne normalement la déficience en Dystrophine et/ou en Laminine alpha-2 (voir détail dans l’article en référence).

Ce nouveau travail indique la détection de l’expression de la Dystrophine dans des cellules souches musculaires comme une protéine qui va permettre de réguler leur polarité et agir sur leur division asymétrique. Cet autre  travail indique les Effets de fond génétique sur le phénotype dystrophique chez la souris mdx.

Un nouveau travail sur la dystrophie musculaire chez les chiens Golden Retriever (DRG) présente parfois des animaux  qui sont légèrement touchés (dit épargné), ont une force musculaire fonctionnelle, et une durée de vie normale en dépit de l’absence totale de la Dystrophine. Actuellement des données obtenues avec le couplage, et le séquençage du génome entier, via des analyses du  Transcriptome de ces chiens par rapport aux animaux sévèrement atteints GRMD (dit affecté)  et à des animaux  contrôles révèlent que l’expression accrue du gène de Jagged1, qui est  un régulateur Expression de Jag-1 chez le chien Golden Retrieverconnu de la voie de signalisation Notch, est une caractéristique du phénotype léger enregistré chez ces animaux. En fait , le produit du gène Jagged-1 (JAG-1= 133 kDa , locus 20p11.1-p12.23) est un ligand pour de multiples récepteurs de la voie de signalisation et Notch et semble impliqué dans les décisions des destins cellulaires lors de l’hématopoïèse,  dans les stades précoces et tardifs de développement cardio-vasculaire des mammifères et fut impliqué dans l’inhibition de  la différenciation des myoblastes et par ailleurs capable d’améliorer l’angiogenèse induite par des facteurs de croissance des fibroblastes.

Dans ce travail des analyses annexes fonctionnelles démontrent que la surexpression Jagged1 améliore le phénotype Dystrophique, ce qui suggère que Jagged1 peut représenter une nouvelle cible pour la thérapie DMD de manière indépendante à la réexpression de la Dystrophine.  Cela est présenté dans un diagramme résumant la situation chez ces 2 animaux modèle de la DMD

Dans cette nouvelle étude est présenté un suivi sur la fonction contractile du muscle chez la souris mdx d’une tentative de rétablissement de la nNOSμ sarcolemmique. Pour atteindre cet objectif, il est décrit  une forme modifiée de nNOSμ (NOS-M) qui est ciblée sur le sarcolemme par une palmitoylation, qui est fonctionnelle même en l’absence du complexe des protéines associées à la Dystrophine. Pour cela comme indiqué dans l’article en référence le transgène produit pour cette étude possède une séquence de signaux de palmitoylation C-terminale obtenue à partir de l’oncogène K-ras pour cibler cette version de nNOSμ au sarcolemme. Ainsi exprimé dans  le muscle squelettique de la souris la forme (NOS-M) est capable d’atténuer considérablement la perte de force due aux effets délétères des contractions excentriques et des contractions isométriques répétitives (fatigue), tout en améliorant la récupération de vigueur après la fatigue. Par contre l’expression de nNOSμ non modifié à des niveaux similaires ne conduit pas à l’association sarcolemmique et ne parvient pas à améliorer la fonction musculaire. Mis à part les avantages de la localisation sarcolemmique de la production de NO, la forme (NOS-M)  permet également d’augmenter les niveaux à la surface de la membrane de l’Utrophine et des autres protéines complexe des protéines associées, à savoir le Bêta-Dystroglycane, l’ Alpha-Syntrophine et la Dystrobrévine. Ces résultats suggèrent ainsi que l’expression de la forme NOS-M dans le muscle squelettique peut être thérapeutiquement bénéfique dans la pathologie DMD et d’autres maladies musculaires caractérisées par la perte de nNOSµ au niveau du sarcolemme.

Des progrès récents semblent capables de favoriser de nouvelles perspectives pour une thérapie génique réussie de la DMD, et le travail présenté dans ce rapport indique et illustre  les développements les plus prometteurs.

Comme il existe actuellement un besoin urgent de biomarqueurs fiables qui peuvent être utilisés pour surveiller et suivre  l’efficacité des thérapies expérimentales en ce qui concerne la myopathie de Duchenne (DMD)et les essais cliniques associés. Dans ce travail figure une identification de nouvelles protéines en tant que  biomarqueurs  très abondants avec parmi les protéines sériques,  cinq principales protéines candidates (Pgam1, Tnni3, Camk2b, Cycs et Adamts5) qui ont été validées par la méthode ELISA sur  des échantillons extraits de tissus de souris. Notons par ailleurs que la protéine  Adamts5 a été trouvée avec un taux significativement élevé dans le sérum du patient DMD humain. Ainsi cette étude a permis d’identifier de nouvelles protéines comme des biomarqueurs sensibles à des traitements  thérapeutiques dans le sérum de la souris mdx et cette découverte semble d’une utilité potentielle pour une analyse poussée chez les patients souffrant de DMD.

Par ailleurs , comme un grand nombre de protéines identifiées selon leur masse moléculaire par spectrométrie présentent une abondance altérée plus particulièrement dans le cerveau au cours d’une analyse protéomique générale des tissus chez la souris MDX-4cv cela suggère des changements physiologiques complexes. Par exemple il est observé des niveaux accrus de la protéine acide fibrillaire gliale, un composant de filament intermédiaire qui est associé de manière unique avec les astrocytes dans le système nerveux central, impliquent une neurodégénérescence  associée à une astrogliose. De plus il y a  régulation à la hausse de l’ Annexine et de la Vimentine ce qui  représente probablement l’existence de mécanismes compensatoires impliquées dans la réparation de la membrane et la de stabilisation du cytosquelette en l’absence de Dystrophine au niveau du cerveau. Ces résultats et d’autres (voir détails dans l’article en référence), mettent en évidence des adaptations métaboliques et des changements fonctionnels dans le système nerveux central du phénotype dystrophique. Ainsi les protéines mises en lumière dans ce travail apparaissent comme des protéines à considérer  en tant que biomarqueurs protéomiques et leurs suivis est à enregistrer dans les approches prédictives, de diagnostic, de pronostic et / ou thérapie  et de surveillance durant le traitement des anomalies cérébrales dans les Dystrophinopathies.

stimulation de la voie de signalisation Wnt par ANDROLa voie de signalisation Wnt-5a améliore la transmission synaptique inhibitrice dans un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne. Pour cela l’utilisation du  constituant majeur d’Andrographis paniculata, l’ Andrographolide (ANDRO), qui a été décrit comme ayant des propriétés protectrices dans le cerveau. Ce produit ANDRO peut par exemple protéger contre la dépréciation du cerveau lors de la progression de la maladie d’Alzheimer mais aussi  réduire la dégradation musculaire chez la souris mdx Dans ce récent travail il est montré  que l’activation de la voie Wnt-5a stimulée par le produit  ANDRO améliorer l’efficacité des récepteurs GABAergique de l’hippocampe chez la souris déficiente en Dystrophine en augmentant le nombre de synapses inhibitrices GABAA-R. Ces résultats indiquent que la signalisation Wnt est susceptible lorsqu’elle est stimulée de moduler l’efficacité  synaptique GABA et pourrait être une nouvelle cible prometteuse pour une thérapie cognitive applicable en cas d’absence de Dystrophine.Un schéma récapitulatif montre la relative  dispersion des récepteurs GABA dans le cas d’une absence de Dystrophine au niveau de l’hippocampe tandis qu’une stimulation par le produit ANDRO va stimuler un efficace regroupement de ces derniers comme cela est présenté en 2 illustrations ci-contre.

Dystrophine et cellules souches musculairesCe travail indique que la Dystrophine possède un nouveau rôle non négligeable dans le processus de stimulation des cellules souches et le processus de réparation musculaire. Une illustration pointe en avant que l’absence de Dystrophine va avoir des conséquences sur le fait que des cellules souches musculaires vont rester dormantes et ne pas ou peu participer au processus de réparation. Directement traduite de cette schématisation figure la version en français  de cette représentation, la présence de la Dystrophine et des principaux facteurs de différenciations musculaires dans les cellules satellites musculaires est indiquée  dans ces cellules souches avec les couleurs de violet pour la Dystrophine, et vert (Mark2), brun pâle (Prd3) et jaune pâle (Myf5).

Le transposons dont le sigle est «  piggyBac » est construit pour exprimer la totalité de la séquence de la Dystrophine humaine c qui selon le travail cité en référence va permettre une   correction génétique au niveau des mésoangioblastes dystrophiques. Cette étude est réalisée sur des cultures de cellules et des schémas didactiques sont inclus dans l’étude et illustre la manière dont ces constructions sont réalisée. Cela donne une nouvelle perspective pour une approche thérapeutique de la déficience en Dystrophine On observe que des études menées chez le chien myopathe il existe une reprogrammation directe des fibroblastes qui est dépendante de l’environnement et se trouve ainsi influencée par le voisinage des cardiomyocytes.

Dans un travail relativement important de la fin de l’année 2015, une mise à jour des données concernant la  Dystrophine est largement disponible et illustrée par des schémas par lesquels sont résumés  les diverses données acquises par la recherché dans ce domaine. En particulière le schéma du portrait-robot de la Dystrophine est repris pour y indiquer diverses relations de voisinages. Un schéma récapitule ces données comme indiqué dans l’illustration présentée ci-contre (voir illustration dans la fiche Dystrophine (Découverte)).  Dans ce rapport il y est par ailleurs  rapporté que le premier bilan est qu’une absence de Dystrophine provoque une perturbation des voies de signalisation du  muscle squelettique.

Physiologie musculaire et impact des ROS et du NOEn particulier les rôles du calcium et des espèces  Réactive de l’Oxygène  (ROS) et de l’oxyde nitrique (NO)  dans le développement de la dystrophie musculaire sont abordé en détails. Ainsi  ce rapport  montre que  le processus du dommage fonctionnel entraîné par l’absence de Dystrophine est complexe. Les voies de signalisation délétères sont soulignées et le processus de la fibrose est clairement indiqué dans le texte de l’article. L’ensemble de ces données est résumée par un tableau dans l’article original.  Une  illustration générale présentée ci-contre  donne un bilan de la physiologie musculaire et de l’impact des ROS et du NO.

L’axe des diverses approches thérapeutiques figure également dans cet article. cibles et approches pour corriger un muscle déficient en DystrophineEn particulier il est  mis en avant le type de cibles qui semblent préférentielles. Les encadrés sur fond rouge indiquent la variété et la nature  des approches thérapeutiques déjà mises en place. Un schéma replace le muscle et indique de la présence des vaisseaux sanguins proches.  Les produits utilisés pour diverses tentatives déjà réalisées sont indiqués au niveau de la zone de leur efficacité. On pourra consulter des détails supplémentaires dans ce bilan qui permet de saisir rapidement les cibles et les approches envisagées et/ou envisageables. Une illustration présentée ci-contre indique les cibles et approches pour corriger la déficience en Dystrophine dans le muscle selon les informations de l’article en référence.

Preuve de la tolérance hypoxique dans le cas de  faiblesse des muscles des  voies aériennes supérieures chez les jeunes souris mdx. La présence du Sarcospane permet de réguler la réponse cardiaque à l’isoprotérénol et empêche le développement d’une cardiomyopathie associée à la  myopathie de Duchenne. Une étude sur les effets de la sur-expression du Sarcospane est bien décrite dans cet article et se décline en 5 points bien identifiable (voir illustration en fin d’article). Il s’agit chez la souris : a) d’une augmentation de l’association avec l’Utrophine et l’Intégrine via  une participation avec les protéines associées normalement avec la Dystrophine ; b) d’une augmentation des liens avec les Laminines ; c) d’une plus grande stabilité de l’intégrité membranaire ; d) d’une amélioration de l’organisation tissulaire et de la fonction cardiaque ; e) une réduction de l’hypertrophie cardiaque.

Cascades dégénérative d'un muscle déficient en DystrophineCette nouvelle revue illustre des approches métaboliques et en relation avec des apports nutritionnels pour traiter la  dysrégulation énergétique au niveau des défauts entraînés dans un muscle par  la myopathie de Duchenne. Dans un premier schéma un muscle normal possédant la Dystrophine se trouve soumis à un ensemble de voies de signalisation en réponse à des contractions excentriques et suite à une production normale d’ ATP, avec une restauration du muscle via les cellules satellites et une homéostasie calcique régulée. Par contre un autre schéma récapitule l’ensemble des évènements qui sont consécutif à une absence de Dystrophine dans la membrane musculaire. Une illustration du muscle altéré figure dans l’article en référence et l’ensemble des dégradations suite à la déficience en Dystrophine sont inclus dans l’illustration ci-contre.

Dans cette étude il est présenté une stratégie avec  le virus adéno-associé  utilisé pour fournir le système / cas9 CRISPR dans le modèle de souris mdx de DMD pour éliminer l’exon muté  23 du gène de la Dystrophine. Une telle approche pourrait représenter une nouvelle voie de thérapie au niveau des cellules musculaires mais aussi pour les cellules  souches musculaires. Cet autre  travail rapporte une procédure pour que la modification postnatale  du génome puisse permettre de restaurer partiellement expression de la Dystrophine dans un modèle de souris de la dystrophie musculaire.

Une stratégie nouvelle de thérapie semble être la surexpression génétique de la protéine « Serpina3n » ce qui va  atténuer la dystrophie musculaire chez les souris. Une stratégie de  Thérapie avec de la Sérotonine et de l’Histamine augmente les Forces tétaniques des myoblastes, et cela permet de réduire la  lésion musculaire et améliorer l’adhérence cellulaire et les performances de la force musculaire chez la souris mdx

Dans  les muscles squelettiques on identifie actuellement des Spirales Cylindriques (=CSs) formées par de rare mais distincte accumulation du sarcolemme comme constituées longitudinalement par du réticulum sarcoplasmique, Tandis que des agrégats tubulaires (=TAs Tubular aggregates)  sont composées à la fois des zones de  jonctions et du réticulum sarcoplasmique. Ainsi une coloration immunochimique avec des anticorps dirigés contre la Calséquestrine et le récepteur de la Ryanodine RYR1 peuvent aider à distinguer ces 2 altérations pathologiques.

Complexome autrour de la Dystrophine dans le muscle squelettiqueLes myofibres squelettiques de type  rapides chez la souris mdx expriment des structures « demi-canaux » (hemichannels), associés aux Connexines (chez la souris, Cx43) qui mènent cette fibre musculaire vers l’apoptose. La spectrométrie de masse et l’approche biochimique permettent d dresser le profil du  « complexome » autour de la Dystrophine ciblé sur le  muscle squelettique. Un schéma récapitulatif tente d’illustrer les différents évènements en fonction du compartiment cellulaire et des protéines plus ou moins déficientes comme cela est présenté ci-contre en rapport direct avec le diagramme de l’article original.

Une déficience en Dystrophine conduit à une instabilité de l’intégrité de la membrane et une forte augmentation des flux de calcium induits par le stress ce qui conduit à une dysrégulation de canaux sarcolemmiques tels que la famille des canaux calcique dits TRPs (= Transient receptor potential) et en particulier le canal TRPC2. Dans ce travail, l’entrée de cations divalents a été exploré dans un ventricule isolé de type sauvage (Wild Type =WT) et/ou MDX et les cardiomyocytes furent analysés dans deux conditions différentes (voir détails dans l’article original. Les  résultats présentés dans cette étude suggèrent que l’activation des canaux de type  TRPV 2   jouent bien  un rôle clé dans l’afflux de calcium et participent à la dérégulation des cardiomyocytes déficients en Dystrophine soumis à des  conditions d’étirement.

Ce travail rapporte les conditions pour une restauration efficace du cadre de lecture et finalement la présence d’une structure correcte de la Dystrophine au niveau des myoblastes Il s’agit de l’utilisation de la méthode dite «  Cindel » (=CRISPR-induced deletion), qui permet sur des exemples précis et de plus amples détails sur les conditions à utiliser de réaliser une restauration de la Dystrophine comme cela est indiqué dans l’article en référence.

La dégénérescence du muscle cardiaque  et une analyse de  la structure du muscle cardiaque chez la souris mdx sont présentées en détails  dans ce travail avec de potentielles  implications cliniques pour une meilleure évaluation de la  myopathie de Duchenne. Chez la souris déficiente en Dystrophine on observe qu’une altération cardiaque est le résultat d’une hypoxie induite.

Dans ce travail présente  un bilan sur les possibilités d’épissage alternatif pour sauter l’exon 23 contenant un codon STOP et réaliser une suite sans problème des exons 22-24 au niveau de la Dystrophine et testé chez la souris.

De l’hydrogène moléculaire atténue les déficits moteurs et la dégénérescence musculaire chez la souris mdx. La méthode proposée est de de prendre l’eau sursaturée en hydrogène (> 5 ppm) à volonté jusqu’au sevrage de la descendance. Les jeunes souris mdx ont alors pris de l’eau sursaturée en hydrogène du sevrage jusqu’à l’âge de 10 et/ou 24 semaines puis les animaux seront sacrifiés pour une analyse et une évaluation des effets. Le bilan de l’action de l’hydrogène permet de voir diminuer le nombre de noyaux centraux des fibres musculaires chez les animaux de10 et/ou 24 semaines. Par ailleurs il est observé un marquage pour la nitrotyrosine dans le muscle Jumeau chez les animaux âgés de 24 semaines et une tendance à voir augmenter les expressions des protéines comme la glutathion antioxydase, la peroxydase, ainsi que le facteur anti-apoptotique Bcl-2, dans le muscle squelettique dès l’âge de 10 semaines. Ces bons résultats sont favorables à une tentative d’application chez l’homme en utilisant un tel protocole thérapeutique. Par ailleurs, le manque de Dystrophine affecte de manière significative l’épithélium bronchique chez la souris mdx.

Retard de la myogénèse via IP3 en absence de DystrophineDu fait  que le muscle du fœtus ne soit pas influencée par la gravité et ne souffre pas de charge mécanique et / ou sujet à un quelconque processus d’inflammation, cette étude concerne uniquement des muscles DMD fœtaux d’un sujet âgé de seulement  12 semaines.  Un tel matériel permet de mettre en  évidence pour la première fois le début des altérations dans les voies de signalisation mise en place suite à une absence  la Dystrophine.  Il est alors constaté  que la cascade de signalisation PKC / IP3 / IP3R / Ryr 1 / Calcium (2 +)  y est très active et que la protéine de PKCa dépendante du calcium, exerce un rôle de régulation fondamentale qui a pour conséquence de retarder la myogénèse.  De telles  données fournissent de nouvelles perspectives sur l’origine de la pathologie  DMD au cours du développement musculaire et un schéma récapitulatif indique comme via une relation avec les Dystroglycanes mais l’absence de Dystrophine la pathologie se met progressivement en place.

Une étude chez la souris déficiente en Dystrophine indique que la stratégie qui consiste à neutraliser les récepteurs de l’interleukine-6 conduit à une amélioration de la dysfonction gastro-intestinale.

En 2016, une analyse comparative du transcriptome indique les variations que l’on rencontre aussi bien pour le cas de3 types de  dystrophies musculaires dite : s Largemyd, Dmdmdx/Largemyd et  Dmdmdx. De nombreux diagrammes en couleur montrent les différences chez ces trois types d’animaux pour un âge de 21 jours, de 3 mois et de 6 mois.

Une nouvelle approche thérapeutique permet d’obtenir une protection efficace contre la cardiomyopathie dépendante de la déficience en Dystrophine. Ces expériences sont pratiquées chez la souris, et ce travail démontre qu’un nouveau  donneur d’oxyde nitrique, le Nicorandil, va protéger contre la mort cellulaire induite par le stress au niveau des cardiomyocytes déficients en dystrophine. Les résultats montrent comment ce produit entraîne une protection de  la fonction cardiaque chez souris mdx soumise à des altérations provoquées par un cycle  ischémie/reperfusion. Ceci suggère un potentiel rôle thérapeutique potentiel pour ce produit le Nicorandil dans le cadre des cardiomyopathies induites chez les DMD.

L’analyse protéomique dans le cœur du déficit en dystrophine et les changements associés avec l’âge dans un modèle de sourismdx4cv avec une cardiomyopathie liée à un profil de dystrophinopathie. Ce travail fait appel à la bio-informatique et permet ainsi d’identifier grâce au programme PANTHER les voies métaboliques potentiellement altérées, et avec la base de donnée STRING les principales cibles protéiques qui sont sur-exprimées. (Voir illustrations et détails dans l’article en référence).

Cette nouvelle étude présente des résultats originaux  sur des sections musculaires et des extraits musculaires de souris mdx âgées de 2 à 3 mois. Ce travail  indique la participation de la Cathepsine S (CTSS) comme protéase lysosomale à groupement cystéine qui est impliquée de manière importante dans  l’évolution de la pathogenèse de la dystrophie musculaire chez la souris.La présence d’hexose associé permet d’améliorer la livraison d’oligonucléotides que l’on va utiliser pour provoquer un  saut d’exon chez la souris mdx déficientes en dystrophine. La mélange GF (2.5% Glucose:2.5% fructose) est particulièrement efficient dans ce protocole.

Une nouvelle avancée est mise au point chez la souris pour un diagnostic non invasif permettant de mieux identifier l’état « normal » d’un muscle.  Il s’agit d’utiliser  la myographie  par impédance électrique  (EIM) pour détecter les effets de la stimulation électrique musculaire au niveau d’un muscle normal comparativement à un muscle déficient en Dystrophine. Une originale et précise caractérisation de cellules souches d’origine neurale est maintenant disponible dans un article pour une étude chez la souris déficiente en Dystrophine.  (Utilisation d’une large batterie d’anticorps disponibles commercialement est indiquée dans un tableau récapitulatif au sein de ce travail).

Dans le cadre de la thérapie pour permettre une réexpression de la dystrophine dont le gène est altéré, il est proposé d’utiliser la Staurosporine, un antibiotique naturel.  Un tel traitement permet en effet de supprimer la mutation non-sens  de l’exon 31 (c.4303G > T  soit, p.Glu1435X) et alors d’obtenir une dystrophine tronquée ne possédant pas l’exon 31 avec restauration d’un taux satisfaisant de Dystrophine. Ce travail est obtenu en culture cellulaire de cellule HeLa exprimant des mini gènes de Dystrophine muté ou normale sur lesquels ce traitement est réalisé.

Des souris et des hommes face à la Dystrophie musculaire de Duchenne, peut-on actuellement mieux comprendre le défaut génétique entraînant  une  cardiomyopathie  et donner les bonnes Informations quant à des traitements possibles pour les autres maladies myocardiques? Voila les questions que soulève ce travail. Une nouvelle étude donne de meilleures notions sur les altérations au niveau de la jonction synaptique  de la zone correspondant à la jonction neuromusculaire chez les diverses souris  modèles de la maladie de Duchenne. (Voir nombreuses images en immunofluorescences de ces NMJ dans  l’article original en référence).

comparaison de la distribution musculaire des muscles de la cuisse chez le chienCette nouvelle approche commente les analyses obtenues  avec la technique de l’ IRM (imagerie en résonance magnétique) utilisée pour mieux identifier le volume des muscles de la cuisse  en particulier chez le chien déficient en Dystrophine. Ces animaux  présentant une réduction de l’expression qui est corrélée avec une  croissance musculaire inégale et une plus grande fréquence contractures articulaires. Le protocole utilisé et les illustrations en couleur des analyses IRM montrent en particulier l’évolution de la densité des muscles des muscles des membres du pelvis dans le plan transversal au niveau de la mi-cuisse (plus de détails dans l’article en référence). Comme illustré ci-contre est présenté une image type de ces comparaisons chez un animal contrôle par rapport à des animaux déficients en Dystrophine mais exprimant plus ou moins la Myostatine.

Les données contenues dans ce travail  confirment l’efficacité de la Quercétine comme traitement par voie orale possible pour traiter la DMD chez la souris  dans le muscle squelettique, cependant, elles indiquent également le que la sensibilité à  la Quercétine est dépendant de l’âge des sujets traités et qu’une supplémentation continue ne parvient pas à  stimuler à long terme  la voie PGC-1α. Toutes ces données ne concerne que  la souris mdx, mais cela semble en particulier améliorer la fonction des muscle respiratoires .

 

Dans ce travail il s’agit de l’Identification dans le cas d’une cardiomyopathie de biomarqueurs circulant comme étant des miRNA. Ces derniers au nombre de 3 miRNA sont désignés sous les termes : miR-26a, miR-222 etmiR-378a-5p et leur présence est à corréler avec la sévérité d’une pathologie cardiaque en cours d’évolution chez les DMD comme chez les BMD ce qui n’avait pas encore mis en évidence. Un dosage de ces MiRNA est donc un nouvel outil utile à  mettre en place pour un tel diagnostic.  Un récent bilan fait état qu’une stratégie d’ablation génétique ou  une inhibition pharmacologique de l’entité P2RX7 chez la souris modèle de DMD va favoriser une atténuation fonctionnelle des symptômes liés à l’absence de Dystrophine aussi bien aux niveaux  musculaires que non musculaires. Cela fait de l’entité P2RX7 une cible préférentielle pour une future thérapie. Une activation de la voie de signalisation impliquant  l’entité Wnt3a va favoriser la différenciation des cellules souches mésenchymateuses chez la souris déficiente en Dystrophine.

cibles potentielles du resveratrolLe Resvératrol est un composé polyphénolique naturel produit par les plantes dans diverses conditions de stress. Le Resvératrol a été rapporté pour présenter des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et antiprolifératives au niveau des cellules de mammifères et chez divers modèles animaux, et pourrait donc avoir des effets bénéfiques dans différents états physiopathologiques. Plus récemment, le Resvératrol a été également montré potentiellement capable de cibler de nombreuses voies métaboliques mitochondriales, y compris celle de la bêta-oxydation des acides gras ou de  la phosphorylation oxydative, ce qui conduit à une régulation positive du métabolisme de l’énergie par l’intermédiaire des voies de signalisation impliquant PGC-1α, SIRT1 et / ou la kinase AMP-dépendante. Un schéma récapitulatif illustre ces diverses cibles potentielles pour lesquelles  les mécanismes d’action restent cependant à découvrir.

Chez la souris  la voie de signalisation impliquant IL-1 de type Bêta  (=pro-inflammatory cytokine interleukin 1β), est inhibée spécifiquement, via  Kineref-1 et/ou  IL-1Ra (25 mg/kg/jour) et les effets sont rapportés dans ce travail sur les améliorations que cela entraîne sur le muscle déficient en Dystrophine.

Ce travail concerne la souris et l’ensemble des études sue les déficits de flexibilité cognitive qui seront la conséquence de  l’absence de la dystrophine native de forme longue. Cet autre article apporte un bilan chronologique et historique sur l’évolution des diverses approches de thérapies utilisant divers vecteurs viraux comme véhicules pour permettre  l’édition du gène DMD dans un muscle ou la dystrophine est altérée voire absente. On trouvera ainsi depuis 2014 jusqu’à nos jours en 2016, les différents jalons sur les approches virales utilisées  pour permettre  des thérapies génétiques somatiques de la myopathie de Duchenne, qui sont résumés dans une seule figure (Fig1 de l’article en référence) et largement commenté dans cette revue.

Le taux d’expression du récepteur purinergique P2Y2 est régulé à la hausse (54%) dans le cœur dystrophique par rapport à un cœur normal. La présence de Suramine permet de réduire  les niveaux d’expression  du récepteur  P2Y2 à des valeurs presque normales.la présence de  Suramine va également permettre de diminuer la nécrose cardiaque (réduction de la  CK-MB) et de l’expression du canal TRPC1.

Un essai préclinique a été mené récemment chez le chien golden retriever atteint d’une dystrophie musculaire (=DRG) due à une déficience en Dystrophine. Ce traitement fut engagé via une injection  locorégionale d’une construction nucléotidique nommée «   rAAV8-U7 snRNA »  pour promouvoir le saut d’exon sur le messager de la dystrophine canine. Des échantillons musculaires bien caractérisés pour leur pourcentage de fibres Dystrophine positives provenant de ces animaux ont alors pu être soigneusement analysée et un seuil minimal de 40% de fibres dystrophine-positives est alors déterminé comme  nécessaire pour le rétablissement des protéines centrales essentielles pour un bon fonctionnement de la force contractile du muscle. En particulier ce travail porte sur le seuil de présence  de dystrophine nécessaire pour une  normalisation du taux de nitrosation des protéines telles  la nNOS, la iNOS et le récepteur  RyR1 dans le cadre de la Dystrophinopathie chez le chien DRG.

Nogo4 et kir4.1 dasn les cellules de Müller de la rétineCette étude porte plus particulièrement sur l’entité Réticulon 4A  (=Nogo-A)  qui est découvert comme capable d’influencer  la distribution des Kir4.1 au niveau des cellules gliale de Muller de la rétine sans que cela  soit essentiel à la conductance de potassium dans ces cellules. Une illustration permet de visualiser la distribution respective des protéines  Nogo-4 et  Kir4.1 par rapport au reste de la cellule de Müller et la présence du complexe autour de la Dp71 et des protéines associées au sein de la rétine.

Un nouveau traitement est  testé chez la souris déficiente en Dystrophine. En fait ce travail, en référence,  révèle qu’un nouveau facteur de croissance et de différenciation dénommé (rGDF11) qui était identifié comme le  premier de ces facteurs sensé rajeunir les cellules souches « = facteur de la jeunesse » ne semble pas selon les données présentées apporter une quelconque amélioration dans les performances du muscle dystrophique.

Une nouvelle souris dont le gène de la Dystrophine est manipulé de manière à ce que la Protéine, devenant elle-même fluorescente, soit localisée  spécifiquement (construction dite « DMD- (EGFP) » .  Cela semble un modèle intéressant pour suivre en tant que  reporter l’expression de la Dystrophine dans tous les tissus.

Les différences liées à l’âge révèlent un  Impact sur le transfert de la Force par les différentes protéines  en relation avec l’intégrité membranaire et la stabilité des  jonctions neuromusculaires et en particulier cette étude remet en lumière le rôle majeur qu’y joue la Dystrophine.  

Le dysfonctionnement cognitif dans la myopathie de Duchenne: est abordée systématiquement au vue des résultats chez la souris et une un rôle possible pour les molécules immunitaires neuromodulatrices est envisagé suite à une compilation des résultats actuellement connus sur la stabilité autour des protéines membranaires situées accrochées à la membrane et des protéines inflammatoires induites par l’absence de Dystrophine.

Dans ce travail il est indiqué que la dystrophine surexprimée à hauteur de 100 fois, mais pas de seulement 50 fois conduit à une aggravation des défauts électrocardiographiques dans le modèle de la souris mdx de dystrophie musculaire de Duchenne.

Ce travail fait un bilan sur le traitement pour la restauration de la dystrophine qui améliore à la fois la chute de la force induite par l’allongement des contractions et réduit l’exitabibilé dans le muscle squelettique chez les souris mdx dystrophiques.

stimulation des cellules souches musculaires par les cellules TrégulatricesLes cellules inflammatoires et immunitaires jouent un rôle non négligeable dans la régénération du muscle squelettique. En effet différents types de cellules inflammatoires, y compris les neutrophiles, les éosinophiles et les macrophages, sont recrutés sur le site correspondant à une altération de la membrane musculaire. Les macrophages de type M1 participent à la suppression des fibres musculaires nécrotiques et apoptotiques  tandis que les macrophages de type M2 agissent sur les cellules satellites du muscle favorisant la différenciation et la croissance musculaire. Les éosinophiles libèrent IL-4, ce qui stimule les fibro-adipocytes progéniteurs (FAP) et ceux-ci à leur tour, favorisent la différenciation des cellules satellites. En outre, les dommages musculaires sont détectés par les cellules dites «FAP-like », qui libèrent IL-33.Ainsi  IL-33 va recruter et activer les cellules  Tregulatrices. Ces cellules induisent la libération d’un facteur de croissance, l’Amphiréguline (AREG), qui elle stimule la différenciation de cellules satellites du muscle et favorise la régénération musculaire. Une action sur les macrophages des cellules Treg existe aussi et l’ensemble de ces informations figurent dans une illustration présentée ci-contre  avec plus de détails dans l’article original.

Dans ce travail c’est une surexpression spécifique du muscle de la forme IGFBP2 qui semble favoriser un phénotype musculaire plus lent chez les souris saines mais pas chez les souris mdx dystrophiques et cela n’a aucune incidence sur la pathologie dystrophique.

L’élimination de la production d’espèces oxygénée réactives  (ROS) par le cytochrome Nox2 protège un muscle squelettique dystrophique de l’impact pathologique de la fuite de calcium,  évaluée in vivo par IRM amélioré avec utilisation du manganèse. (Manganese enhanced MRI (MEMRI). Cette étude est réalisée chez des souris hybride dont une sous unité de Nox2 est déficiente.

Le développement, la structure et la maintenance de la membrane  musculaire chez le modèle animal  C. elegans . Cette revue donne de récentes informations et propose de nombreuses illustrations sur la présence des protéines musculaires et en particulier indique la particularité des versions spécifiques  des protéines, comme la Dystrophine, que l’on trouve chez cet animal modèle.

Un  travail original présente la diminution de courant potassium vers l’intérieur dans les cardiomyocytes ventriculaires déficients en dystrophine.  Cette recherche, effectuée chez la souris, présente la première preuve  fonctionnelle pour un rôle important du complexe associé à la Dystrophine (DAPC)  dans la régulation des canaux potassium Kir2.1 en particulier au niveau du muscle cardiaque.

Un bilan de Fibrose, de faible vascularisation, et de l’expression de moins de fibres musculaires lentes se confirme être le résultat d’une déchirure d’un muscle. Ce travail permet la Validation de l’échographie comme technique pour  une évaluation non invasive de la fonction de la membrane dans la dystrophie musculaire. Des  progéniteurs mésenchymateux des muscles squelettiques  sont capable de  différenciation en cellules fibroblastes résidentes mais aussi  en adipocytes et de telles cellules associées avec le sigle « PDGFR de type a » ont été associés à la pathogenèse dans les muscles squelettiques de souris mdx . Cette signalisation via les « PDGFR de type a » est démontrée dans ce travail comme capable de  favoriser les réponses fibrinogènes dans les cellules riches en collagène participant ainsi à l’installation de la fibrose d’un muscle dans la myopathie de Duchenne.

Applications Récentes chez l’homme :

 

Cette recherche  originale met en évidence les paramètres immunitaires affaiblis et les évènements  qui se produisent comme une conséquence de cette altération immunitaire sur l’évolution de la maladie génétique de Duchenne. Ce rapport  discute  ainsi sur  la façon dont les changements d’immunité peuvent  potentiellement atténuer l’intensité de la maladie et être utilisé en conjonction avec des efforts pour corriger un tel désordre génétique engendré par l’absence de la Dystrophine.

Une transplantation intrapéritonéale de cellules Mésoangioblastiques ciblées de type donneur compatible HLA  semble donner de bons résultats  dans le cadre du potentiel traitement de la maladie de Duchenne chez l’homme suite à une stratégie d’application décrite en détail dans l’article indiqué.  Deux mois après la dernière perfusion, une biopsie musculaire a été effectuée. Le bût de cette étude fut dans un premier temps de tester la sécurité de la procédure et cette dernière fut décrétée relativement sûre. Un seul patient traité  a développé une lésion Thalamique vasculaire  sans conséquences cliniques et dont la corrélation avec la perfusion de mésoangioblastes restait incertaine. Une IRM bien documenté a permis de suivre la progression de la maladie chez 4/5 patients. Des mesures fonctionnelles ont été transitoirement enregistrées chez  2/3  des patients ambulants, mais aucune des améliorations fonctionnelles attendues n’ont été observées. Si une telle procédure est donc bien envisageable sans risque pur proposer une nouvelle thérapie chez les patients Duchenne, elle devra être appliquée chez des enfants plus jeunes pour obtenir un espoir de résultats plus positifs.  

La version Dp412e est une nouvelle  isoforme humaine de la Dystrophine induite par BMP4 dans le stade du début de  différenciation des cellules. Cette nouvelle isoforme de la Dystrophine décrit dans cet article  est une forme traduite à partir de l’exon 6 et se trouve ci-après dénommé « Dp412e » (« e » pour embryonnaire). La nouvelle protéine de Dystrophine correspond  à un poids moléculaire de 412 kilodaltons (kDa), elle est caractérisé par a un premier exon spécifique non traduit qui est conservée seulement dans un sous-groupe des anthropoïdes y compris l’homme,  et va donner comme résultat une protéine ayant son domaine de liaison à l’actine tronqué en position N-terminale. (voir chapitre la famille des Dystrophine ou la forme Dp412e figure dans l’illustration des formes longues de Dystrophines).

Dans ce rapport on trouve un protocole pour obtenir une amélioration de l’efficacité de la reprogrammation de cellules souches pluripotentes induites à partir de humaines de patients atteints de la  Dystrophie musculaire de Duchenne et la cinétique d’évolution de telles cellules. (Voir de nombreux détails dans ce travail sur  la génération de cellules dites « DMD-iPSCs »).

Une nouvelle signature de la déficience en Dystrophine est rapportée comme étant en relation avec le réseau de collagène et sa relative forte densité au sein de la matrice extracellulaire. En particulier il est observé que la protéine LOX  (Lysyl Oxydase, chez l’homme LOXL1 et/ou LOXL4  ) si elle possède une répartition intramusculaire relativement hétérogène dans tous les échantillons, néanmoins la distribution de cette protéine LOX est  augmentée en fréquence et en intensité dans le muscle dystrophique. L’étude est réalisée chez la souris avec un anticorps anti-LOX produit par (Novus NBP2-24877; 1:500), mais aussi chez le chien et chez l’homme  avec un anticorps anti-LOX produit par (Abcam ab31238; 1:500).

Cette étude démontre ce que des analyses précises avaient détectées sur la disparité des muscles squelettiques et que la généralisation n’était que partiellement possible. En effet il existe maintenant  des preuves que sur un groupe musculaire précis une amélioration et un  sauvetage peut-être réussi, mais les données suggèrent également que d’autres facteurs encore indéfini peuvent sous-tendre une variabilité observée sur d’autres groupes musculaires dans le succès d’une stratégie thérapeutique par saut d’exon. La présente  étude si elle indique bien que dans tous est muscles est relativement le taux de restauration de la Dystrophine  insaisissable, elle  met également en évidence des défis associés à la quantification de la Dystrophine présente au départ puis au cours des essais cliniques où une seule petite biopsie musculaire est prélevée  seulement sur 1 muscle précis chez un patient DMD donné.

Divers articles ont déjà révélés que la réponse immunitaire inflammatoire contribue également à la progression de la maladie chez les patients atteints de DMD. Il existe en effet  des niveaux plus élevés de cellules  T circulantes dites de type « CD49dhi et CD49ehi » chez les patients atteints de DMD par rapport à un échantillon  contrôle en bonne santé. Pourtant il faut tenir compte du fait que les patients souffrant de DMD sont cliniquement hétérogène et que ce taux de cellules T circulantes ne peut pas être clairement mis en corrélation avec le génotype. Par conséquent, il est important d’être en mesure de définir des biomarqueurs fiables non invasifs, et  pour mieux suivre la progression de la maladie avant et pendant des essais cliniques, les auteurs de ce travail proposent de doser le taux de lymphocytes t circulant de type CD4(+)CD49d(hi) et  CD8(+)CD49d(hi)  pour obtenir rapidement une corrélation fiable avec la sévérité et la progression de la pathologie DMD . Cependant ce travail montre également que l’utilisation d’un peptide dirigé contre la forme CD49d (Peptide anti-CD49d) et/ou un anticorps spécifique (Sigma)  semble pouvoir être efficace en tant que nouvelle stratégie  thérapeutique pour faire diminuer l’inflammation tissulaire et les altérations qui en résultant chez le patient Duchenne.

Schéma des différents épissages de la transcription de la DystrophineDans ce nouveau travail est présenté une mise à jour de la taille et la complexité du gène codant pour la Dystrophine. Il correspond en effet à 79 exons, avec de longs  introns, possède  7 différents promoteurs, et  2 sites de polyadénylation ce qui génère  de nombreux transcrits alternatifs. Tout cela  a toujours entravé la caractérisation du transcriptome du gène DMD et dans ce travail est présenté une analyse originale très détaillée ainsi que l’approche qui a permis de mieux définir son organisation. Une représentation de l’épissage séquentielle et non-séquentielle de la transcription de la Dystrophine est présenté dans un schéma récapitulatif qui présente des lignes pleines et des lignes pointillées entre deux exons indiquent un épissage non-séquentielle préférentiel (respectivement lente et intermédiaire,), tandis que les introns épissés séquentiellement  ne sont pas représentés. La forme de l’exon reflète l’échelonnement des exons basé sur la partition du triplet du codon en fin de l’exon (un exon de forme pointue indique que  l’exon se termine à la fin d’un triplet, tandis que pour les formes  | et < cela indique que ces triplets sont coupés). Deux couleurs, noir et bleu pâle,  ont été utilisées pour améliorer la visualisation.

La génération de cellules souches pluripotentes chez des patients atteints de la myopathie de Duchenne est analysée quant à la procédure pour les induire plus particulièrement  au niveau des  cardiomyocytes.

La microscopie en immunofluorescence de la protéine  SNAP23 (=« Synaptosomal-associated protein 23 « , une protéine de la famille des SNARE)  dans le muscle squelettique humain révèle une colocalisation avec la membrane plasmique, avec des gouttelettes lipidiques, et en contact avec les mitochondries.

De nouvelles générations de Séquençage permettent de détecter  une mutation non-sens dans le gène de la Dystrophine à partir de cordon ombilical séché et bien préservé. Des détail sont informatifs sur cette analyse dans l’article en référence.

Le cas particulier d’un patient qui ne possède que la délétion de l’exon 5  de la Dystrophine ce qui ne compromet pas la reconnaissance de l’exon 6, et bien que la suppression ne perturbe pas le cadre de lecture, se présente avec une forme clinique qui est bien plus grave que celle prévu pour une dystrophie musculaire classique de type Becker. De plus large détails sont indiqués dans l’article en référence avec un guide d’approche pour programmer des stratégies de saut d’exons.

Cette analyse sur plusieurs exemples concrets démontre l’importance du diagnostic génétique pour la Dystrophie musculaire de Duchenne. En particulier sur la figure N°3 de la référence indiquée il est donné très simplement un aperçu en 3  différentes étapes du protocole à suivre pour réaliser une recherche de mutation suspectée sur le gène DMD.

L’absence du facteur d’épissage  CELF2 (CUGBP Elav-like family member 2) et plus particulièrement son isoforme  Celf2a, permet comme cela est rapporté dans l’étude en référence de convertir un génotype Duchenne en un phénotype Becker.

Des cellules souches autologues qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer la Dystrophine sont un moyen possible de traiter la myopathie de Duchenne (DMD). En effet dans ce travail deux nouvelles constructions de la Dystrophine, correspondant aux constructions C1 (ΔR3-R13) et C2 (ΔH2-R23) dont un schéma est disponible dans l’article original, peuvent être converties via une transduction avec un vecteur viral (Lentiviral)  en MDC (muscle derived cells)  et  produire de  la Dystrophine qui étaient totalement fonctionnelle in vivo.

Une nouvelle étude propose un Diagnostic prénatal non invasif des dystrophies musculaires de Duchenne et Becker par rapport à un dosage haplotype  (voir les conditions dans l’article en référence).Une récente étude démonte une régulation concordante avec sur-expression de l’Utrophine chez des frères, patients DMD/BMD qui présentaient cependant des phénotypes nettement différents. Un cas particulier chez un patient Duchenne présente pour la première fois une association avec le syndrome de Duane.

Dans leurs récents travaux, Young et al., (Young et al., Cell Stem Cell. 2016 Feb 10) démontrent et illustrent dans plusieurs schémas récapitulatifs la possibilité d’utiliser une unique paire de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées de nucléotides en l’associant à l’endonucléase Cas9  (=CRISPR/Cas9)  pour corriger le cadre de lecture dans la majorité des  cas de pathologie DMD. (consulter également la fiche Dystrophine (Thérapies) avec l’illustration sur l’ensemble des outils disponibles pour une thérapie génique).

Une telle stratégie est applicable chez environ 60% de la population des patients atteints de Dystrophinopathie. Ce sera donc une stratégie personnalisée puisqu’elle va tenir compte du type de mutation/délétion que possède le gène DMD du patient considéré. Selon le type de délétion/mutation présent au sein du muscle du patient DMD il est possible avec le protocole suggéré par Young et al.(2016), de supprimer en une seule étape une zone comprise entre les exons 45 et 55.  La méthode va  permettre une délétion allant de 530  jusqu’à  725 paires de bases pour  obtenir un cadre de lecture correct du gène DMD altéré chez ce sujet. Dans un premier temps il s’agit d’obtenir du patient quelques fibrobastes porteur du gène DMD altéré et de transformer ces cellules humaines en cellules souches pluripotentes de manière à obtenir une lignée stable que l’on pourra facilement mettre en culture et gène DMD mutéet retauration du cadre de lecturedifférencier en cellules musculaires pour en multiplier le nombre (hiPSC – Derived Muscle Cells). Ensuite un petit ARN servant de guide (gRNA) construit de manière complémentaire à un site spécifique du génome, est utilisé pour cibler la nucléase Cas9 sur la séquence à exciser  et induire alors des cassures ciblées du double brin d’ADN codant pour la Dystrophine. Les doubles brins d’ADN rompus seront alors ensuite réparés par le biais d’une fin de jonction de type non homologue ou via  une réparation  dirigée par homologie.  Une telle approche permet d’obtenir une Dystrophine dont une portion interne est  absente (concernant la région des exons 45 à 55) et de réaliser une élimination par exemple de l’exon 46 à 51, ou au maximum une lecture directe sautant de l’exon 44 vers l’exon 56 comme cela a été observé avec la détection d’une mini-Dystrophine d’origine naturelle chez un patient qui ne présentait qu’un profil bénin d’une dystrophie de Becker (BMD).
En outre, dans ce travail les auteurs observent une  restauration d’une  Dystrophine tronquée  associée avec le  bêta-Dystroglycane in vivo après une greffe de muscle squelettique dérivée de cellules hiPSC appliquée chez le modèle murin  de la DMD. Un schéma général récapitulatif des diverses étapes mentionnées plus haut est proposé par les auteurs. Il suggère qu’une application à l’homme pourrait-être prometteuse car elle conduira à une amélioration de la qualité de vie du patient DMD vers le statut moins sévère de patient BMD. La stratégie CRISPR/Cas9 si elle est applicable dans le cadre de la DMD elle peut s’appliquer efficacement dansd’autres cas de Dystrophis musculaires comme cela est montré en détail par exemple pour  le cas de la FSHD

Spectre des mutations du gène DMDUne nouvelle étude présente le diagnostic génétique de la dystrophie musculaire de  Duchenne / Becker  en utilisant un type de séquençage dit de « génération moderne « . Cette analyse permet démontrer sur certains exemples la validation de nombreuses mutations sur le gène DMD . Les auteurs utilisent un nouvel ensemble de primer multiplexe couvrant 100% de la séquence codante du gène DMD, avec utilisation d’une nouvelle méthode à haut-débit de séquençage, la « technologie Ion Torrent ». Les résultats seraient de 92% par rapport à une détection de mutation de l’ordre de 70% par les méthodes conventionnelles MLPA/Sanger. Il est par ailleurs proposé un diagramme simple qui selon cette technique offre 98% de chance d’obtenir un résultat sur l’échantillon présenté, quant au type d’altérations que l’on rencontre généralement dans cette pathologie plus ou moins sévère du muscle avec seulement 2% de cas non résolu. Une retranscription de cette simple illustration est présentée ci-contre.

Cette analyse originale permet de définir une nouvelle variante de dystrophinopathie avec un mosaïcisme somatique en raison d’une variante de réversion causant une hémi-atrophie: En particulier il est ainsi rapporté l’existence d’une duplication spécifique des exons 3-4-5-6-7qui s’intègre avant l’exon 8 et se trouve responsable du cas présenté dans l’article en référence.

Ce travail montre pour la première fois une corrélation des niveaux d’expressions relatives de l’Utrophine avec le complexe des protéines normalement associées à la Dystrophine en fonction de la régénération des fibres musculaires chez le Duchenne et le Becker Dystrophie musculaire suite à une analyse détaillée de biopsies musculaires. Pour obtenir ce résultat utilisation d’un anticorps monoclonal dirigé contre l’Utrophine (NCL-DRP2 IgG1 Novocastra avec une dilution  1:3 ) et en association avec des  anticorps dirigés contre les chaines de Myosine  fœtale et développementale ((Novocastra MHCn et Novocastra MHCd, avec des dilutions respective de  1:15 et 1:20). Le résultat majeur est que le pourcentage de régénération les fibres musculaires au sein d’une  biopsie musculaire est en corrélation avec la sévérité clinique du patient Becker et/ou Duchenne. Ainsi les biopsies musculaires de patients Becker présentent moins de fibres en régénération et une intensité de fluorescence liée à la présence d’ Utrophine moindre par rapport aux biopsies musculaires du patient Duchenne.

Un récent bilan sous forme d’interview de Mars 2016 permet de disposer des récentes perspectives  sur le remplacement du gène codant pour la Dystrophine et des types de thérapies utilisées.

Dystrophine tronquée (sans la séquence des exons 3 à 9)La possible suppression des exons 3 – 9,  englobant une des zones mutationnelles à forte fréquence au niveau du gène codant pour la Dystrophine et qui se traduit  par  un phénotype asymptomatique, représente un nouvel axe thérapeutique. Cette zone cible est éliminable avec la technique du saut d’ exons et de ce fait on va obtenir une Dystrophine tronquée qui garde intégralement intact la reste de la molécule mais permet d’avoir une zone N-terminale plus courte et fonctionnelle, voir détails dans l’article en référence). La génération d’une telle Dystrophine tronquée est illustrée dans un schéma comparatif issu de l’article indiqué et présenté ci-contre.

Une étude sur un patient âgé de 20 ans et souffrant d’une  Dystrophie de Becker et son évolution est proposée dans cet article en regard avec une thérapie cellulaire.  Ce rapport suggère finalement que la combinaison entre une thérapie cellulaire (Transplantation de cellules souches issues de sa propre moelle (bone marrow mononuclear cell (BMMNC) transplantation) avec une réhabilitation multidisciplinaire de l’ensemble de son activité musculaire semble favorable à la réadaptation du sujet et peut offrir une possibilité de réparer et de régénérer ses fibres musculaires, ce qui en définitive va conduire à ralentir efficacement l’évolution de ce type de Dystrophie musculaire.

cibles de la SinvastatineDans ce travail,  comme l’indique le schéma récapitulatif, les cibles potentielles pour la Simvastatine sont  le stress oxydatif, l’inflammation et la fibrose, qui se révèlent comme étant  les principales causes de la physiopathologie associée à une altération de la Dystrophine. . Compte tenu de la nécessité immédiate pour  établir des thérapies qui se prêtent à tous les patients souffrant de la pathologie DMD  indépendamment de leur âge ou de la spécificité de la mutation sur la dystrophine, il semble que la Simvastatine serait d’un grand potentiel pour fournir une thérapie facilement disponible pour les DMD avec un bon rapport coût-efficacité.

Potentialité des cellules souches en balanceDans ce travail original il est établi qu’une  régénération musculaire efficace et une homéostasie tissulaire normale étaient  gérées par un équilibre entre un processus de divisions de cellules souches satellite de manière symétrique et/ou  asymétrique . Une telle balance au sein des cellules satellites est didactiquement illustrée par le schéma suivant provenant directement de l’article en référence.

 

Une seule nouvelle mutation au sein de la structure de la Dystrophine ,  décrite pour de jeunes patients d’origine Grecque, qui correspond à la perte d’un seul acide aminé le résidu Histidine en position 1690 (exon 36 ; c5068_5070 del Cac) va induire un profil DMD dont l’incidence clinique semble actuellement  faible avec cependant une augmentation de la créatine kinase (CK > 200 IU/l). L’évolution de ce type de mutation demande encore du temps pour en définir définitivement la gravité. La position de cette mutation est indiquée dans le schéma général compilant les mutations sur la Dystrophine et qui figure au début de la présentation de la fiche intitulée « Dystrophine Thérapie les pistes ».

Pathogénèse et Thérapies de la DMDCette nouvelle revue indique sous une nouvelle forme les informations sur le gene codant pour la Dystrophine avec les différent dérivés de cette famille issus du même gène, une localisation membranaire illustrée par un nouveau schéma simplifié ainsi qu’un tableau illustrant la pathogénicité due à une déficience en Dystrophine ainsi que les principaux axes de thérapies existants de manière courantes mais aussi moins courantes avec également les axes de thérapies actuellement émergents. Une telle illustration générale,  mais aussi axée sur les cardiomyopathies provoquée par l’absence de Dystrophine,  est traduite en français ci-contre (voir détails dans l’article original en référence).

Les résultats présentés dans ce travail permettent d’identifier une régulation spécifique au  niveau de  l’oreillette par le RNA dénommé « miR-31 » dans le cas de la fibrillation auriculaire (=Atrial fibrillation ; AF) chez l’homme. Ainsi une surexpression de «  mir-31 » va induire un mécanisme clé provoquant un épuisement de nNOS et de la  Dystrophine auriculaire  qui à son tour contribue à un phénotype auriculaire engendrant une arythmie. Ainsi ce travail met en avant que la cible « miR-31 » pourrait être à considérer comme  une cible thérapeutique potentielle dans le cas d’une fibrillation auriculaire AF.

Parmi les cellules dérivées  spécifiquement  de myoblastes de patients atteints de DMD,  il existent bien des concordances mais avec des phénotypes variés comme le démontre l’analyse et l’utilisation des cellules souches  pluripotentes humaines dite : s h iPSC =human induced pluripotent stem cells ».

conformation antive et ou mutée de la dystrophine R16-21Un tiers des cas de Dystrophie musculaire de Becker (BMD) qui concernent des délétions d’exon avec conservation du cadre de lecture  sont situées dans la région codant pour les répétitions de type Spectrine-like R16 à R21. Dans cette étude 2  des mutants qui concernent les régions;Rmuté45-48 et Rmuté45-51 conduisent à des pathologies bénignes et présentent une structure similaire en triple super hélice similaire à celle de la région R16-21, tandis que 2 autres mutants concernant les régions, Rmuté45-47 et Rmuté45-49, induisent des  pathologies plus sévères et présentent des structures « fractionnaires » sans rapport avec la structure normale. En fait, dans les modèles présentés chaque mutant de délétion a montré plus d’interactions avec les membranes que la protéine native. Cela signifie que des mutations dans la partie de la dystrophine R16-21 sont susceptibles de perturber le comportement moléculaire de la protéine en ce qui concerne les membranes, indépendamment du fait que la pathologie qui en résulte soit bénigne ou grave. Pour illustrer cette étude sur les altérations présentées ici en rapport avec un statut de patient Becker une représentation de ces zones répétitives en 3D est présentée en indiquant plus particulièrement avec un cercle en pointillé les zones ayant un intérêt particulier (Voir détail dans l’article original.)
Par ailleurs, un bilan sur les cardiomyopathies diagnostiquées chez les patients Becker avec un diagramme simplifié indiquant la fragilité membranaire due à l’altération de la Dystrophine, les fuite calcique en résultant et le test de la Troponine dégradée comme marqueur de la déficience du muscle cardiaque.

Cette nouvelle étude sur les Dystrophinopathies,  présente une analyse rétrospective des dossiers médicaux de 54 patients atteints de DMD, qui vivaient dans un établissement régional pour personnes handicapées (Wichernhaus Altdorf, Allemagne) entre 1963 et 2013. Ceci est une étude qui finalement démontre un indique un risque accru d’accident ischémique cérébral chez les patients atteints de DMD.

Cet autre  travail indique que la stratégie de thérapie du saut d’exon  utilisant des oligonucleotides antisens (Aos = Antisense oligonucleotides)  se trouvait améliorée dans le cas de l’utilisation de « phosparodiamidate morpholino-oligomer (=PMO) » par la présence de fructose (25 mg.kg) en place de la solution saline souvent employée. Ceci se traduit, dans le cas d’une application chez la souris, par une détection d’environ 4 à 25% de fibre positives pour la Dystrophine chez un animal traité. Ainsi ce travail suggère que le fructose potentialise la stratégie PMO en améliorant l’absorption.

Puis un nouveau bilan sur des patients Becker et Duchenne indique que chez la population iranienne il a été réalisé une évaluation précise et une mise en évidence de nouveaux points de mutations. Cela est intégré dans le schéma du gène de la Dystrophine présenté dans la partie « Pistes Thérapeutiques » de ces fiches sur la Dystrophine et révèle sur fond coloré la position et l’identification de 3 nouveaux variants.

Ancrage membranaire de la Dystrophine différent selon le muscleUne reprise de l’analyse détaillée des divers domaines de la Dystrophine donne une approche plus complète de l’arrangement général de la protéine en rapport avec son ancrage membranaire. On va différencier les domaines membranaires de cette protéine flexible selon le muscle squelettique et/ou selon le muscle cardiaque avec la présence de  liaisons indépendantes qui coexistent au long de cette structure et pour matérialiser les résultats un schéma résume la situation pour ces 2 types de muscle strié comme cela est démontré en détail dans l’article original en référence.

Il est par ailleurs indiqué dans ce travail précis qu’un prétraitement Antisens est susceptible d’ augmenter l’efficacité de  la thérapie génique pour les muscles dystrophiques.  Un protocole détaillé est présenté et  cette analyse basée sur l’utilisation de vecteurs de type AAV souligne le fort impact de ce type d’approche combinée pour améliorer le bénéfice de cette approche thérapeutique permettant d’une part l’utilisation de doses plus faible de vecteur et donc plus sûres pour d’autre part obtenir un niveau d’expression de la Dystrophine plus grande à long terme.

Dans ce nouveau travail il est pointé en avant que la Dystrophine est une protéine requise pour un fonctionnement correct de la luminance et du principe antagoniste rouge/vert des cônes  dans la rétine humaine.

Une analyse précise des tumeurs non myogéniques indique qu’une expression altérée de la dystrophine conduit à une fréquence plus élevée d’altérations génétiques. Cette étude représente donc une preuve validant que  la DMD doit être considéré comme  un nouvel acteur dans le développement tumoral et comme un nouveau facteur de pronostique pour suivre une  progression tumorale. Une revue propose également  les plus récentes approches de thérapies innovantes  concernant la Dystrophie de Duchenne. Ce travail s’appuie en particulier sur des résultats cliniques et des conséquences observées. Voir le cas particulier de l’utilisation d’un oligonucléotide antisens pour éliminer la lecture de l’exon 51 permettant ainsi  d’obtenir une élimination de l’exon 50 et de l’exon  51 et une construction stable passant de l’exon 49 à l’exon 52 et la suite. En effet une délétion de seulement l’exon 50 conduira à un RNA qui produit une dystrophine courte et dégradable.

Une expansion des répétitions de trinucléotides dynamique (TNR) dans le gène DMD est analysée en détails dans cette étude. En particulier une dynamique inattendue de l’expansion, de
trinucléotides (GAA) 
allant d’environ  59-82 répétitions GAA  pures, dans la zone de l’intron 62 du gène  DMD a été observé (cas particulier d’une famille sur  trois générations). Ainsi cette étude montre que présente l’expansion dynamique de triplets GAA – dans la région polymorphe du gène de la  DMD, ( intron 62) et indique sa  possible association avec un phénotypes BMD. Des études précises menées  principalement chez le rat mais aussi  confirmées  chez l’homme permettent avec ce travail de mieux définir la distribution et l’expression de la Dystrophine dans le cadre épilepsie expérimentale du lobe temporal.

Les effets du Sildénafil,  un médicament conçu pour la dysfonction érectile (impuissance),  révèlent une action  sur le développement cérébrovasculaire chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Becker comme le montre cette analyse angio-graphique par résonance magnétique  (MR angiography). De plus, dans ce nouveau travail il est démontré que le traitement avec du Tadalafil, un autre produit normalement utilisé pour des trouble de l’érection, se trouve susceptible de retarder l’apparition de la cardiomyopathie dans le cœur déficient en Dystrophine chez l’homme.

Dans ce travail des altérations liées à l’âge sont plus particulièrement en relation avec  l’environnement sarcolemmique mais peuvent être ont atténuées via un régime impliquant systématiquement des exercices volontaires  et des restrictions  alimentaires  en terme de calories prises.

Cet article compile les informations actuelles  sur les diverses stratégies de  thérapies géniques qui  vont permettre de rétablir l’expression de la dystrophine pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. Une première figure compile les informations ciblées sur les exons  44 à 56 qui se traduisent soit par un statut DMD soit par un statut BMD.  Puis les auteurs présentent et illustrent une stratégie d’édition de Génome pour créer une séquence ciblée sur des changements au niveau de l’ADN génomique.  Puis il existe  une schématisation qui résume la stratégie d’utilisation d’oligonucléotides antisens (AON) pour «sauter» un exon au cours du traitement de l’ARNm et de rétablir ainsi le cadre de lecture de la dystrophine.

Dans ce travail c’est l’utilisation du Givinostat, un inhibiteur de l’histone déacétylase dont le potentiel est connu comme agissant en tant qu’anti-inflammatoire, anti-angiogénique et sur les activités anti-néoplasique. Le bilan est donné ici pour l’utilisation du Givinostat chez des garçons avec Dystrophie Musculaire de Duchenne,  (dont l’âge moyen est de 8,2 ans et le profil précis de chacun d’entre eux résumé dans un tableau),  quant aux effets histologiques que l’on peut alors constater.

Une nouvelle notion émane de cette  étude originale qui rapporte que la fréquence et le degré de gène entraîné par des symptômes de LUT (Lower Urinary Tract) et de néphrolithiase chez les patients DMD et/ou BMD. En dépit de cette forte prévalence, le rapport montre que la majorité des patients  ne sont pas particulièrement gênés par ces symptômes; Cependant, plus de 16% ont exprimé leur insatisfaction avec leurs LUT actuels. Avec cette population de patients qui vivent maintenant plus longtemps, cela peut devenir encore plus répandue. Dépistage des LUTS gênants chez les patients atteints de DMD et BMD devrait être une partie de la gestion de la maladie, avec un traitement ou une référence appropriée à un urologue pour ceux dérangés par leurs symptômes et une telle stratégie devrait avoir un impact positif sur leur qualité de vie.

(Suite dans le chapitre Dystrophine Avancées depuis Septembre 2016)