Calpaïne-3

Introduction

Les Calpaïnes forment une large famille de protéases calcium dépendantes qui possèdent une cystéine réactive. La nomenclature de ces protéines a évolué au cours de leurs découvertes et on les classe de type I ou II soit également de type m ou p ( voir revue ). Il existe une version musculaire de la Calpaïne dite p94 mais aussi nommée « nCL-1 » ou Calpaïne-3. Il a été développé un anticorps monoclonal disponible commercialement qui détecte la forme non clivée de 94 kDa dont on trouve les références chez  Novocastra .

Portrait robot comparatif des calpaïnesCette  fiche spécifique concerne plus particulièrement la Calpaïne de type 3. Sur l’illustration suivante le portrait-robot de la Calpaïne-3 est présenté en comparaison avec le profil type des Calpaïnes avec une nouvelle terminologie plus adaptée à l’évolution de nos connaissances. Cela montre bien que les Calpaïnes constituent  un système protéolytique très élaboré.

On va trouver dans toutes les Calpaïnes conventionnelles et une sous-unité un domaine catalytique et une autre régulatrice.  Ainsi au sein de la structure des Calpaïnes  les diverses régions sont mentionnées comme suit :

  • Un petit tronçon N-terminal  (=Nt)
  • Les domaines PC (Protease Core) dit  PC1 et PC2 formant le cœur de la partie enzymatique
  • Le domaine  C2L, dit « C2-like » formant la zone catalytique
  • Le domaine PEF (L/S), contenant 5 EF-hand (=Penta EF), pour ce qui concerne la grande (L) et/ou la petite sous-unité (S).

On trouvera également dans le même article un portrait-robot récent qui permet de mieux visualiser l’architecture interne de la plus longue des protéines baptisée « Calpstatine » et en particulier de comparer cette structure avec celle présentée ci-dessous pour l’ensemble  de la  famille des Calpaïnes.

En résumé, la Calpaïne-3 est  composée de 4 domaines codés de I à IV . Le domine II est le domaine possédant l’activité protéasique avec la cystéine réactive (rectangle noir). Le domaine IV est le domaine qui présente le plus de liaisons au calcium sous la forme de main EF (rectangles verts numérotés de 1 à 6). Les fonctions des domaines I et III ne sont pas clairement définis bien que le domaine III possède une main EF de liaison au calcium. La région NS (N-terminale) est unique et riche en résidus Proline mais aucune fonction spécifique ne lui a été attribuée. Les zones dites IS1 et IS2 ne possèdent pas de similarité avec les diverses séquences actuellement connues, mais sont impliquées dans la fonction de la protéine en régulant son autolyse.

Tableau des séquences de Calpaïne-3Toutes ces informations sont réunies dans un schéma provenant de la revue précédemment citée comme cela est indiqué ci-dessous.On a réuni les principales données séquentielles sur la Calpaïne-3 dans le tableau suivant et sur lequel plus de détails peuvent être consulté dans le lien suivant : ( P20807). 

  Ainsi de nos jours les Calpaïnes sont référencées comme un système élaboré de protéolyses qui va intervenir au niveau du muscle en fonction des demandes des remodelages nécessaires. Une nouvelle nomenclature va donc découler de cette nouvelle organisation interne des Calpaïnes On va également trouver dans la littérature un récent article qui fait le bilan de la Calpaïne apicale en utilisant comme animal modèle C elegans. Dans cet article on trouvera toutes les références sur un arbre phylogénétique résumant l’ensemble des versions de Calpaïnes actuellement connues

diverses formes de CalpaïnesUne plus récente illustration propose également un autre arbre phylogénétique avec la distinction entre les Calpaïnes classiques et  les Calpaïne dites non classiques ce qui permet d’en saisir l’immense variabilité. De plus dans le même article on trouvera un résumé  de l’ensemble des fonctions et des régulations des « Calpaïnes », en mettant l’accent sur les possibilités de pathologies cardiovasculaires associées aux « Calpaïnes ».

Progressivement plus de 14 différentes versions de Calpaïne ont été décrite et la conformation de la mini Calpaïne 1 est décrite dans le travail ici indiqué.

Conformation spatiale de calpaïnesOn va ainsi de mieux en mieux connaitre avec des études de RX la structure spatiale pour la calpaïne-3 au niveau de la liaison du calcium au sein des structures dites  « EF= EF Hand » . Le calcium , cercle jaune, permet de plier la séquence dans une conformation spécifique qui favorise ensuite l’action de protéolyse spécifique que va entraîner la présence de calpaïne-3 sur ses cibles préférentielle, on parle alors du système « calpaïne » induit par le calcium.

Le système « Calpaïne »

 Parmi les systèmes protéolytiques il existe plusieurs voies qui vont conduire à une atrophie musculaire qui ne résulte pas simplement d’un effet inverse par rapport à l’hypertrophie. Il est par ailleurs confirmé que les Calpaïnes jouent un rôle important dans la maintenance de la masse musculaire et qu’en particulier un contact existe entre Calpaïne et le type 1A des protéines kinase phosphoinositides 3 (=PI3K) en ce qui concerne la régulation de leurs activités et de leurs rôle dans les voies de signalisations cellulaires  Ainsi son activité protéolytique sur la kinase PI3K a-t-il été mis en évidence plus particulièrement dans les neurones et les conséquences d’une telle activité sont rapportées en détails dans l’article en référence.

Il est par ailleurs établi que l’activité de la Calpaïne était essentielle pour une bonne réparation de la peau, et contribuait ainsi à la cicatrisation. Cependant les changements morphologiques et moléculaires dans le muscle semblent être atténué si les Calpaïnes sont inhibées (cas particulier des rats dits « experimental allergic encephalomyelitis rats »). Par ailleurs des études récentes rapportent qu’un étirement passif des muscles va réduire l’activité des Calpaïnes par la voie de l’oxyde nitrique (NO) : cas du muscle Soleus. Mais il apparait selon  une étude réalisée dans différents muscle de bœuf que l’on puisse observer une certaines variabilités dans l’expression des isoformes de Calpaïnes.

localisation cellulaire de la CalpaïneEn fait, les Calpaïnes sont aujourd’hui référencées comme un système élaboré de protéolyses qui va intervenir au niveau du muscle en fonction des demandes des remodelages nécessaires. On va ainsi localiser la calpaïne-3 dans la cellule musculaire comme largement distribué au niveau de la ligne M et de la ligne N2 au niveau de chaque sarcomère comme cela figure dans une illustration schématique provenant de l’étude en référence. Pour le muscle la calpaïne-3 est le «gardien» du sarcomère responsable du bon assemblage, de l’entretien et du remodelage musculaire.

les calpaïnes humainesPar ailleurs,  un répertoire complet des multiples formes de Calpaïnes que l’on a identifié actuellement chez l’homme figure dans l’illustration présentée ci-dessous. On pourra consulter pour plus de détails la référence indiquée.

Cependant chez l’homme pour le muscle en général  on notera en particulier l’importance de l’isoforme dite Calpaïne-3 (encadrée en rouge dans le répertoire de la famille des Calpaïnes, et souvent annotée P94 en référence à son vrai poids moléculaire) dans les cas normaux et pathologiques durant la régénération de tels muscles.

Potentiels substrats de la Calpaïne-3

Chez l’homme il existe  trois types principaux de Calpaïne. L’activité protéolytique de la Calpaïne-3 dans la fibre musculaire est dirigée contre certaines protéines du sarcomère, et des costamères ce qui entraîne une  rupture du cytosquelette d’Actine et la désorganisation des adhérences focales . Mais Il est actuellement possible d’identifier un potentiel substrat de l’activité protéasique de la Calpaïne en utilisant la méthode du FRET (fluorescence resonance energy transfer) associée à des analogues potentiels ( FRET-based substrates ). On a cependant déjà identifié des cibles de la Calpaïne-3 dans de nombreux travaux publiés et chronologiquement ceux-ci concernent les protéines suivantes :

 Pour autant un nouveau rôle de la Calpaïne-3 semble d’être impliqué dans la régulation du calcium au niveau des protéines qui réalisent le complexe de la triade où l’on trouve une association de l’Aldolase et de la Calpaïne-3 capable de se lier avec les récepteurs à la ryanodine ( RyR ) qui forment les canaux calciques. Cependant la diversité des types de Calpaïnes montre la relative homogénéité de ce type de protéase et indique bien que l’activité de ce clivage induit par le calcium fait des Calpaïnes une enzyme qui exerce son activité protéolytique dans tous les compartiments cellulaire et dans tous les types de processus métaboliques

La diversité des substrats potentiels pour la Calpaïne est résumée dans l’article suivant et une illustration donne une potentielle illustration des cibles majoritairement trouvées dans la cellule musculaire (voir détails des séquences cibles).

Relation de la Calpaïne-3 avec une pathologie humaine

Le groupe de recherche du  Professeur Beckmann a permis d’impliquer des défauts de la Calpaïne-3 dans une dystrophie des ceintures référencée sous le sigle LGMD 2A. Rapidement des mutations de la Calpaïne-3 furent identifiées en lien direct avec cette pathologie. En fait il existe de nombreuses données relatives à la déficience en Calpaïne-3.

Dans les lignes qui suivent sont référencées les principales observations :

  1. Calpaïne-3 et LGMD2ALa déficience en Calpaïne-3 pourrait entraîner une disproportion dans le type et la taille des fibres musculaires.
  2.  La déficience en Calpaïne-3 conduit à une fonction mitochondriale anormale avec un déficit énergétique et une plus grande sensibilité au stress oxydant.
  3.  On observe une activation de la Calpaïne-3 après un exercice excentrique intensif .
  4. En général les Calpaïnes jouent un rôle dans la  rupture induite par le calcium du couplage excitation-contraction .
  5. Puis il a été proposé que les symptômes de la pathologie LGMD 2A soient liés à un  défaut de l’auto-protéolyse de la Calpaïne-3 elle-même .
  6. La localisation de la Calpaïne-3 au sein du cytoplasme de la cellule musculaire en fit rapidement un facteur clé de la régulation du sarcomère mais également au cours de la myogenèse pour la mise en place de la taille du sarcomère

Ainsi progressivement sa participation dans le remodelage du sarcomère fut établie comme responsable des débris protéolytiques résultant du clivage des protéines constitutives du sarcomère, débris qui seront ensuite traités par le  système Ubiquitine/Protéasome .

 En résumé on fait actuellement un chapitre spécial pour les pathologies concernant les protéines constitutive du  3° type de filament au sein du sarcomère et dont la protéine centrale est la Titine ce qui est donc relatif aux lignes Z et M. Ce nouveau classement intègre des protéines qui ont un lien direct avec la  Titine , comme la Calpaïne-3 ou la  Téléthonine dont la déficience provoque diverses dystrophies musculaires.

Ainsi la Calpaïne-3 semble jouer le rôle important de « Gardien » de l’assemblage, du renouvellement et de la maintenance et du bon fonctionnement du sarcomère comme illustré dans le schéma suivant directement inspiré de l’article cité. La Calpaïne-3 (en rouge sur cette illustration) se situe aussi bien au niveau de la ligne M qu’à la jonction des bandes A et I (dit N2). (Voir illustration  du sarcomère dans le chapitre le Muscle). Les fragments protéolytiques générés par l’action de la Calpaïne-3 sur les protéines du sarcomère sont traités par la  E3 Ubiquitine-ligase , et après les différentes étapes de la cascada d’ Ubiquitination des fragments de protéines qui sont ensuite dégradés par le Protéasome.

 Tout dernièrement un bilan des déficiences en Calpaïne-3, est disponible dans la référence indiquée sous le terme des LGMDs de type 2A. Dans cette nouvelle approche plus récente un schéma récapitulatif montre les conséquences d’une altération de la Calpaïne-3 dans la cascade de processus qui conduisent à une atrophie musculaire chez les patients atteints de la pathologie LGMD2A.

Avancées depuis 2013

 L’étude de la FSHD (=Fascio-Scapulo-Humeral Dystrophy) en relation avec le protéine FRG1 présente une inhibition de la différenciation musculaire qui accompagne une altération  de la Calpaïne-3 (absence de l’exon 6) et une déficience en Rbfox1 (=RNA binding protein fox-1 homolog 1).

Les Calpaïnes  référencées CAPN1 et CAPN3 présentent respectivement un relatif polymorphisme. Ces protéines possèdent ainsi  des gènes candidats liés aux performances musculaires et finalement à la qualité de la viande chez le poulet. Des informations sur l’hétérogénéité des mutations sur le gène codant pour la calpaïne-3 est analysé chez une population chinoise atteinte de LGMD2A

Un récent travail indique chez  un homme marfanoïde une relative faiblesse des muscles des ceintures. Ce travail indique une technique pour distinguer Calpaïnopathie de dystrophie musculaire de Becker.  Actuellement pour lutter contre l’action de protéolyse associée à l’action de la Calpaïne-3 en présence de calcium une large batterie d’inhibiteurs a été synthétisée et un bilan de ces produits est disponible dans la revue suivante. Au cours du temps le répertoire des mutations sur la séquence primaire de la Calpaïne-3 est largement étoffé par rapport à une étude exhaustive produite en 2008  sur une population italienne,

En 2014, la Calpaïne-3  enzyme spécifique au muscle, est phosphorylée de façon majeure sur le résidu Sérine 629,  et cela doit influer sur la fonction de la Calpaïne-3 dans la fibre musculaire. Ce travail décrit  un état redox et une fonction spécifique de la chaîne respiratoire mitochondriale dans le muscle squelettique chez des patients LGMD2A.

Mutations sur la séquence primaire de la Calpaïne-3 humainePuis  publié en 2015 on peut avoir  un bilan général plus récent des pathologies entraînées avec l’identification des mutations. Cela est ici résumé sous forme de la retranscription de la séquence primaire de la Calpaïne-3 humaine selon le code 1 lettre avec les résidus mutés et/ou éliminés qui sont  indiqués en rouge.

Ensuite en 2015, une étude détaillée sur la pathologie LGMD2A permet de suivre le profile d’expression des pathologies ou l’on peut trouver une implication directe ou secondaire de la Calpaïne-3.  Ce travail présente dans un premier temps le type standard de multiplexe qui peut être utilisé lorsqu’on dispose d’un extrait musculaire pour analyser avec la technique du  Western Blot la présence des protéine à intérêt dans le cas de suspicion de la présence ou de l’absence de calpaÏne-3 dans un Comparaison du taux de CALPN3 avec diverses protéines musculaires en WB Multiplexemuscle de patient dystrophique. On va alors tenter de révéler comparativement le taux de présence dans l’extrait de muscle pathologique pour les protéines suivantes : Dystrophine, Dysferline, Calpaïne-3, Alpha-Sarcoglycane et en contrôle interne la myosine (Voir détails des anticorps utilisé dans l’article en référence). Une illustration de l’analyse est présentée ci-contre.

 

 

Puis dans le cas d’une analyse ciblée sur la Calpaïne-3, la comparaison du taux d’expression est essentiel pour établir une évaluation  avec l’anticorps spécifique Calp12A2, de la proportion relative de la protéine. Un diagramme permet de voir que si les cas de déficience indirecte peuvent présenter des taux variable de l’expression de Calpaïne-3 il peut exister des mutations qui se traduisent par la présence à 100% de la protéine avec un taux normal Taux comparatif de CALPN3 dans les extraits musculairesd’expression. Le diagnostic génétique de la LGMD2Aprésente ainsi des pièges que l’illustration ci-contre met en avant pour alerter le clinicien sur ces diverses éventualités.

 

Plus tard un Cas de Titinopathie (altération de la Titine) est rapporté dans un travail sur les conséquence d’un clivage enzymatique sous la dépendance de la  CAPN3 qui concerne plus spécifiquement l’extrémité C-terminale de la protéine Titine.
La Calpain-3 est également trouvée comme affectant la prolifération cellulaire et stimulant l’oxydation cellulaire mortelle suite à un stress dans les cellules de mélanome.
Association Calmoduline et calpaïne-3Il existe bien avec ce travail une activation autolytique  de la Calpaïne 3 qui va se trouver stimulée  par la protéine Calmoduline. Un tel résultat fait mention  de l’identification sur la séquence de la Calpaïne-3 de la portion notée C2L (résidus 429-623) qui présente une association avec la Calmoduline comme cela est illustré sur le schéma présenté  ci-contre et directement issu de l’article en référence (Voir détails dans l’article).

Une mutation particulière sur la Calpaïne-3 ( c.550delA) est la mutation la plus fréquemment rapportée dans la pathologie des ceintures dite LGMD2A, et la prévalence de cette mutation dans la population polonaise a été étudiée dans ce travail. Il est par ailleurs rapporté dans ce travail,  l’existence de 2 nouvelles mutations qui figurent actuellement sur le schéma de compilations des mutations dans la séquence primaire de la Calpaïne présentée plus haut.

Sur une étude concernant des patients originaires de Lettonie et de Lituanie il est détecté de nouvelles altérations au niveau de la Calpaïne  (c.2288A > G, c.550delA) ; mais également au niveau de la Dysferline  (c.5028delG, c.4872delG) de la Fukutine  (c.135C > T. ; c.826C > A, ; c.826C > A/c.404_405insT et c.826C > A/c.204_206delCTC) et de l’ Anoctamine (c.191dupA ; Voir détails dans l’article en référence).

En conclusion

Pour suivre l’évolution des connaissances de la Calpaïne-3 il existe des banques de données récentes qui sont  automatiquement mises à jour qui répertorient :

A)      La Calpaïne-3avec son lot de références historiques.

B)      Les principales maladies actuellement connues qui résultent d’une mutation ou d’un défaut dans la protéine considérée (avec des références associées).

  • Protéine :  CALPAIN 3; CAPN3
  • Pathologies associées:  MUSCULAR DYSTROPHY, LIMB-GIRDLE, TYPE 2A; LGMD2A